嬰兒血管瘤組織中微小RNA-130a、B淋巴細胞瘤-2的表達觀察

高培培，張蘭成，朱光輝，盧彬，張數青

(天津市口腔醫院，天津300041)

嬰兒血管瘤(Infantile hemangioma，IH)是嬰幼兒常見的良性腫瘤。流行病學研究[1]表明IH發病率4．5%～6．5%。在低出生體重兒和早產兒中IH更為常見[2]。IH的病因尚不明確，可能與組織缺氧、高血管生成活性等因素有關。目前臨床將IH病情分為增殖期(早期快速增殖期、后期緩慢增殖期)和退化期。患兒出生后隨生長發育多數IH能自然消退，不需要臨床介入治療。但伴發感染、潰瘍、出血等病情復雜的IH需要進行治療，位于聲門位置的IH可危及患兒生命。近年來，血管瘤的治療理念發生較大轉變，即由消極等待觀察轉變為積極干預的觀察，普萘洛爾、納多洛爾和激光治療等對IH具有明確療效[3，4]。目前沒有一種治療手段可治愈所有IH患兒，同時臨床尚缺乏評估IH病情進展的可靠指標。研究IH發生、發展中的具體分子機制是目前研究熱點。非編碼RNA可通過影響基因的轉錄、RNA的加工修飾、mRNA的穩定性及影響染色體結構的裝配等，對細胞活動發揮重要的調節作用，進而調節機體免疫功能、炎癥反應及腫瘤的發生發展等病理生理學過程。根據核苷酸的長度，非編碼RNA又可分為小ncRNAs(<200 nt)和長ncRNAs(>200 nt)。微小RNA(micro RNAs, miRNA)是一類由18～25個核苷酸組成小型內源非編碼RNA，miRNA異常表達能調節腫瘤發生發展、血管生成、浸潤轉移等生物學過程[5]。miR-130家族的miR-130a位于11q12上，能夠促進血管內皮細胞的增殖、遷移等過程[6]。B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)家族包括20種促進和抑制凋亡的蛋白，Bcl-2蛋白是一種重要的抗凋亡蛋白。敲除Bcl-2的小鼠血管內皮損傷加重，促進血管病變的發生[7]。目前關于miR-130a、Bcl-2在IH組織中的表達相關報道較少。本研究選取我院2016年1月～2017年1月間收治的IH患兒臨床病理資料，，觀察IH組織中miR-130a、Bcl-2 mRNA及蛋白的表達變化，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇我院2016年1月～2017年1月間收治的IH患兒33例，其中男18例、女15例，年齡1～12月，中位年齡7個月。所有標本術后均經病理診斷為IH。33例患兒均為初次診斷及治療，并排除其他惡性腫瘤，既往未接受激光、藥物注射、手術等治療。33例患兒均行手術切除IH，術中保留IH組織及瘤旁正常皮膚組織。33例份IH組織經HE染色后根據組織結構特點分期為增殖期(組織血管腔不明顯或血管腔呈裂隙樣，內皮細胞數目增多，細胞核較大且濃染)17例份、退化期(血管腔較多且大，內皮細胞數目較少，且染色較淺，超過20%部位有脂肪浸潤或纖維變性)16例份。本研究經本院醫學倫理委員會批準通過，患兒家屬均知情同意并簽字。

1．2 IH、瘤旁正常皮膚組織miRNA-130a及Bcl-2 mRNA檢測 采用熒光實時定量PCR法。分別取20～30 mg的IH、瘤旁正常皮膚組織，在研缽中加入液氮反復研磨3次，1．5 mL的EP管中50 mg勻漿中加入1 mL的TRIzol搖勻，加200 μL氯仿混勻后室溫孵育10 min，4 ℃下離心(12 000 rpm，10 min)后形成三層，取上層水樣層。加入等體積異丙醇，離心后取上清液，75%酒精500 μL洗滌后離心棄上清，加入50 μL的DPEC溶解后，-70 ℃冰箱備用。以總RNA為模板，用PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒(購自Takara公司)進行反轉錄合成目的cDNA(反轉錄引物oligod(36)AGC)，實驗步驟按照試劑盒說明書進行，-70 ℃保存。熒光實時定量PCR檢測：上下游引物設計應用primer5．0軟件設計。miRNA-130a內參選擇U6基因，Bcl-2內參基因選擇β-actin。引物均由ABI生物公司合成。miR-130a特異性引物正向序列：5′-TTCACATTGTGCTACTGTCTGC-3′，反向引物序列：5′-GCTCTGACTTTATTGCACTACT-3′，內參基因U6上游序列:5′-CTCGCTTC-GGCAGCACA-3′，下游序列:3′-AACGCTTCACGAAT-TTGCGT-5′，Bcl-2基因上游引物序列：5′-GGTGGGGTCATGTGTGTGG-3′，下游引物序列：5′-CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC-3′，β-actin基因上游引物序列：5′-CGCGAGAAGATGACCCAGAT-3′，下游引物序列：5′-GGGCATACCCCTCGTAGATG-3′。按照1∶100體積稀釋1 μL的cDNA，加入5 μL的SYBR Green PCR Master Mix、0．4 μL引物。反應條件為：95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，72 ℃20 s，共40個循環。均在熒光定量PCR儀上完成，每個樣本重復3次。以2-ΔΔCt代表miRNA-130a及Bcl-2 mRNA的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1．3 IH、瘤旁正常皮膚組織Bcl-2 蛋白檢測 采用SP免疫組化染色法。取IH、瘤旁正常皮膚組織標本，檢測各組Bcl-2蛋白，免疫組化實驗步驟：用切片機將石蠟包埋標本切片(厚度5 μm)，65 ℃烘箱2 h，常規二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟，梯度水化后高壓鍋內140 ℃、2 min抗原熱修復，自然冷卻，3% H2O2避光滅活內源性過氧化物酶2 min，PBS清洗三次后加入一抗(稀釋比例1∶800)，4 ℃孵育過夜，PBS清洗三次后，加入二抗(稀釋比例1∶500)，37 ℃孵育30 min，DAB顯色5 min，蘇木紫復染3 min，常規梯度脫水后，樹脂封片照相。Bcl-2陽性為內皮細胞膜或胞質出現棕黃色顆粒，采用圖像分析軟件觀察 IH、瘤旁正常皮膚組織Bcl-2蛋白，每張切片選取5個視野(×400)，測算每張切片的平均光密度、陽性面積率，陽性面積率為計數100個細胞中的陽性細胞數，結果取5個視野的平均值。

2 結果

2.1 IH、瘤旁正常皮膚組織miRNA-130a及Bcl-2 mRNA相對表達量比較 IH組織、瘤旁正常皮膚組織中miR-130a相對表達量分別為3.71±1.23、 0.87±0．21，退化期、增殖期IH組織miRNA-130a相對表達量分別為3.68±1．40 、3．72±1．63；IH組織及瘤旁正常皮膚組織Bcl-2 mRNA相對表達量分別為1.213±0.272 、0．614±0．22，退化期、增殖期IH組織Bcl-2 mRNA相對表達量比較分別為3.68±1．40 、3．72±1．63，與瘤旁正常皮膚組織比較，退化期、增殖期IH組織miRNA-130a及Bcl-2 mRNA相對表達量均升高(P均<0.05)。

2.2 退化期、增殖期IH組織及瘤旁正常皮膚組織Bcl-2 蛋白光密度值及陽性面積率比較 退化期、增殖期IH組織及瘤旁正常皮膚組織Bcl-2光密度值及陽性面積率見表1。與瘤旁正常皮膚組織比較，IH組織Bcl-2蛋白光密度值和陽性面積率均升高(P均<0.05)；與退化期IH組織、瘤旁正常皮膚組織比較，增殖期IH組織Bcl-2蛋白光密度值和陽性面積率均升高(P均<0.05)。

表1 退化期、增殖期IH組織及瘤旁正常皮膚組織Bcl-2光密度值及陽性面積率

2.3 IH組織中miRNA-130a與Bcl-2表達相關性 IH組織中miR-130a與Bcl-2 mRNA的表達呈正相關(r=0．451，P=0．008)。

3 討論

IH是嬰兒期最常見的脈管系統腫瘤[8]，女性、早產、低出生體重和多胎妊娠等因素均是發生IH的危險因素。IH多發生于機體淺表部位，少部分位于內臟、肌肉等較深部位，對于特殊部位的血管瘤，如面部、關節、咽喉等處，影響患兒外觀及功能。 IH通常在出生時不存在，經歷瘤細胞增殖階段，退化階段，并最終隨時間延長自行消失。 常見的并發癥包括破潰、出血、感染及瘢痕形成等，在更嚴重的情況下，也可導致視力喪失，氣道受損，充血性心力衰竭和死亡。血管瘤傳統的治療方法較多，如手術、激光、局部注射硬化劑等，但仍有疤痕形成、皮膚色素沉著、血管瘤復發等問題。目前血管瘤的病因尚不明確，病理上表現為血管內皮細胞的過度增殖，合成與分泌功能活躍。近年來，普萘洛爾在治療嬰兒血管瘤中取得良好的療效，具有起效快，不良反應少等優點[9]。

miRNA是一類小內源性非編碼RNA調控分子，長度約18～25個核苷酸，其通過直接結合其靶基因的3′-非翻譯區(UTR)中的靶位點，可以誘導mRNA降解或充當翻譯阻遏物，影響基因表達，參與正常細胞的增殖、分化、凋亡等過程的調控，還參與心血管疾病、腫瘤、慢性炎癥及自身免疫性疾病的病理生理學過程。miR-130家族最初是在調節豬繁殖與呼吸綜合征病毒復制的研究中發現，該家族成員包括miR-130a、miR-130b、miR-301a和miR-301b。miR-130在多數人類癌癥中作為腫瘤促進性的miRNA，例如在膀胱癌中miR-130的上調表達通過促進FAK和Akt磷酸化，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲[10]。研究[11]表明，miR-130a在多種人類惡性腫瘤中異常表達(上調或下調)，包括胃癌、前列腺癌、肝細胞癌及慢性粒細胞白血病等。在IH中觀察到miR-130a水平升高，抑制miR-130a表達后血管瘤細胞增殖能力與血管形成能力下降[12，13]。本研究中，IH組織中的miRNA-130a相對表達量均顯著高于臨近正常皮膚組織中的表達，結果表明miRNA-130a可能與IH的發生發展的過程有關。目前miRNA-130a表達升高的機制尚不清楚，可能與抑癌基因的失活，導致miR-130a基因啟動子過表達有關。miR-130a表達升高后通過結合靶基因的3′UTR區，影響靶基因及下游基因的mRNA的轉錄，發揮調節作用[12]。如其可抑制癌基因CRMP4基因的表達，促進腫瘤細胞增殖、浸潤及轉移[14]。此外，miRNA-130a可與抑癌基因PTEN相互結合，促進腫瘤細胞發生上皮間質轉化，促進腫瘤細胞的轉移[15]。

血管瘤的發生與血管內皮細胞凋亡和抗凋亡系統平衡失調有關。Bcl-2家族是參與細胞凋亡的重要蛋白質，包括抗細胞凋亡的Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Boo等，以及促進細胞凋亡的Bax、Bak、Bok、Bid等成員。Bcl-2蛋白是一種重要的抗凋亡蛋白，主要借羧基端的疏水片段連于線粒體膜、胞膜上。BCL-2蛋白的α-螺旋結構域結合促凋亡的BCL-2家族成員的BH1，BH2和BH3結構域蛋白形成的疏水口袋，這種相互作用的平衡有助于細胞應激狀態下細胞凋亡調節。此外，Bcl-2蛋白可通過影響凋亡過程中內源性途經中的線粒體釋放細胞色素C，并影響內質網Ca2+的釋放，影響Ca2+依賴核酸內切酶活性，發揮抗凋亡作用。本研究中，血管瘤組織中Bcl-2 mRNA及蛋白表達均顯著高于臨近正常皮膚組織中的表達。表明IH中Bcl-2在轉錄和翻譯水平均顯著增高，與以往報道[16]一致。其原因可能是Bcl-2蛋白抑制凋亡的作用抑制正常的細胞凋亡過程，促進血管瘤內皮細胞增殖。此外，本研究結果表明，增殖期血管瘤組織的Bcl-2蛋白表達高于退化期。以往研究中亦表明增殖期血管瘤內皮細胞凋亡水平顯著低于退化期的凋亡水平[17]。目前對Bcl-2蛋白表達調控進而調節凋亡的具體機制尚不清楚，可能與細胞內非編碼RNA調控因子，如miRNA，長鏈非編碼RNA等，通過影響BCL-2基因mRNA的表達有關。有學者在動脈粥樣硬化研究中發現，miR-181a能抑制Bcl-2蛋白表達，進而促進血管內皮細胞凋亡[18]。本研究中，血管瘤組織中miR-130a mRNA與Bcl-2mRNA表達呈正相關，結果表明miR-130a有可能通過上調Bcl-2mRNA表達，進而發揮調節凋亡過程的作用。有學者研究發現血管內皮祖細胞中miR-130a也可通過上調Runx3表達從而間接影響Bcl-2mRNA表達，進而促進內皮祖細胞的增值，影響血管瘤的發生發展[19]。但其具體作用機制有待進一步研究。

綜上所述，IH組織中miR-130a、Bcl-2表達升高，miR-130a、Bcl-2可能通過影響血管內皮細胞增殖和凋亡過程，參與IH的發生發展。miR-130a、Bcl-2有可能成為新的IH治療靶點和預后的標志物，但其具體作用機制有待大樣本深入研究。