基于HPLC-AFS技術研究南極磷蝦油對大鼠臟器中砷形態分布的影響

劉小芳,邱阿敏,唐一新,張輝珍,冷凱良,*

(1.中國水產科學研究院黃海水產研究所,農業農村部極地漁業開發重點實驗室,山東青島 266071; 2.青島海洋科學與技術國家實驗室，海洋藥物與生物制品功能實驗室,山東青島 266200; 3.青島大學醫學院公共衛生學院,山東青島 266021; 4.青島市食品藥品檢驗研究院,山東青島 266071)

南極磷蝦是目前唯一尚未大規模開發且儲量尤為豐富的單種漁業資源,其資源儲量約為6.5～10億噸,年可捕量相當于目前全球海洋捕撈產量的總和[1]。南極磷蝦富含蛋白質、人體所必需的全部氨基酸、Omega-3系列多不飽和脂肪酸、磷脂等,營養價值較高[2-4]。南極磷蝦油是以南極磷蝦粉為原料經提取精制而得,富含EPA/DHA、磷脂以及蝦青素等功能脂質[5-6],具有調節血脂、抗氧化、改善腦細胞功能等多種生理活性[7-9]。2013年我國衛生計生委第16號公告已批準南極磷蝦油為新食品原料,目前其市場價格達到每噸70～120萬,成為南極磷蝦產業最主要的高附加值產品形式。

受原料及加工工藝影響,南極磷蝦油中總砷含量較高,約為2.5～8.3 mg/kg,其中主要砷形態是無毒的砷甜菜堿,而毒性較高的AsⅢ和AsⅤ等無機砷含量極低[10]。但受總砷含量較高的影響,人們對南極磷蝦油的食用安全性仍存在一定疑慮,這也制約了產品市場的發展。因此,闡釋南極磷蝦油及其主要砷形態化合物在體內的代謝、蓄積和轉化情況至關重要。本課題組前期研究證實,大鼠攝食南極磷蝦油及其砷甜菜堿后,85%的砷會在24 h之內隨尿液排出體外;連續攝食30 d后,大鼠體重、臟器指數、血清生化指標和組織病理切片分析均未見明顯異常[11],肝臟和腎臟中總砷水平亦未出現顯著變化。為進一步全面地解釋南極磷蝦油的食用安全性,本研究繼續考察了攝食南極磷蝦油及其砷甜菜堿對動物臟器中不同砷形態含量及相互間轉化的影響,以期為南極磷蝦油的科學消費和應用領域拓展提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級雄性Wistar大鼠 體重180～220 g、生產許可證號SCXK(魯)20140001,青島市實驗動物和動物實驗中心;南極磷蝦油 紅棕色油狀物,貯存于干燥、密封處,總砷含量3.92 mg/kg、無機砷含量0.021 mg/kg、砷甜菜堿含量3.57 mg/kg、二甲基砷含量0.29 mg/kg,青島南極維康生物科技有限公司;大豆油,總砷含量0.037 mg/kg 嘉里糧油(天津)有限公司;色譜純甲醇 美國Fisher公司;磷酸二氫銨、鹽酸、硼氫化鉀、過硫酸鉀、氫氧化鉀等均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司;亞砷酸根離子(AsⅢ)、砷酸根離子(AsV)、一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)、砷甜菜堿(AsB)標準溶液 中國計量科學研究院;砷甜菜堿(AsB)標準品(純度≥95%) 日本Wako公司。

SA5型液相色譜-原子熒光光譜聯用儀 北京普析通用儀器有限公司;7500型電感耦合等離子質譜儀 美國Agilent公司;PRPx-100陰離子交換色譜分析柱(250 mm×4.1 mm,10 μm) 瑞士Hamilton公司;Milliplus 2150型超純水處理系統 美國Millipore公司;30-30K型低溫離心機 美國Sigma公司;FA1004N型電子天平 上海民僑精密科學儀器有限公司;T10型組織勻漿器 德國IKA公司;STARTER 3100型pH計 梅特勒托利多有限公司;KQ-500DE型超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組及大鼠的飼養 SPF級雄性Wistar大鼠30只,隨機分為6組:大豆油對照組(7 d組、30 d組)、南極磷蝦油組(7 d組、30 d組)、添加100 mg/kg砷甜菜堿的南極磷蝦油組(7 d組、30 d組),根據成人每日膳食油脂推薦攝入量25 g等量換算成大鼠每日灌胃劑量為2.625 g油/kg·bw,以最大程度接受南極磷蝦油砷暴露,7 d組連續灌胃7 d,30 d組連續灌胃30 d,飼養環境溫度20～25 ℃,濕度40%～70%,標準飼料喂養,自由飲食飲水。實驗前禁食不禁水12 h,于末次灌胃后24 h,經戊巴比妥鈉麻醉,剝離肝臟、腎臟,液氮速凍后轉移至-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 總砷測定 按照GB 5009.11-2014《食品安全國家標準 食品中總砷及無機砷的測定》中第一法 電感耦合等離子體質譜法的規定執行。

1.2.3 砷形態分析

1.2.3.1 樣品前處理 參照Grotti等[12]的方法進行樣品前處理。稱取0.5～2.0 g大鼠肝臟或腎臟樣品,加入25 mL 90%甲醇溶液勻漿,勻漿液于搖床上室溫振蕩提取過夜,8000 r/min離心5 min,取上清液,旋轉蒸發濃縮去除甲醇,超純水定容至10 mL,經0.45 μm濾膜過濾,待測。

1.2.3.2 液相色譜檢測條件 色譜柱:HamiltonPRPx-100陰離子交換色譜分析柱(250 mm×4.1 mm,10 μm);流動相:流動相A為0.8 mmol/L磷酸二氫銨溶液(pH9.0),流動相B為20 mmol/L磷酸二氫銨溶液(pH8.0),梯度洗脫程序見表1;流速:1.0 mL/min;進樣量:100 μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Program of the gradient elution

1.2.3.3 原子熒光檢測條件 負高壓:320 V;燈絲總電流:100 mA,主電流/輔助電流:50/50 mA;載氣流速:800 mL/min;原子化器溫度:中溫;原子化方式:火焰法;載流:10%鹽酸溶液,流速4 mL/min;還原劑:3%硼氫化鉀溶液(含5 g/L氫氧化鉀),流速4 mL/min;氧化劑:0.5%過硫酸鉀溶液(含5 g/L氫氧化鉀),流速1.5 mL/min。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 流動相的選擇

本研究分析了流動相磷酸二氫銨溶液的摩爾濃度與pH對五種砷形態出峰時間和分離效果的影響(表2)。結果顯示,當磷酸二氫銨溶液濃度小于1.0 mmol/L時,AsB、AsⅢ和DMA三種砷形態化合物可在較短時間內出峰,但MMA和AsV兩種砷形態化合物不能在30 min之內完成洗脫;當磷酸二氫銨溶液濃度大于1 mmol/L時,五種砷形態化合物雖能夠在較短時間內出峰,但AsB、AsⅢ、DMA等三種砷形態化合物的分離效果不佳。GB 5009.11-2014《食品安全國家標準 食品中總砷及無機砷的測定》關于無機砷測定的HPLC-AFS法中規定梯度洗脫采用1.0 mmol/L磷酸二氫銨溶液(pH9.0)和20 mmol/L磷酸二氫銨溶液(pH8.0)作為流動相。

表2 流動相摩爾濃度和pH對不同砷形態化合物保留時間的影響Table 2 Effects of the flow phase concentration and pH on the retention times of the five arsenic compounds

本研究發現,采用0.8 mmol/L磷酸二氫銨溶液(pH9.0)與采用1.0 mmol/L磷酸二氫銨溶液(pH9.0)進行洗脫時,效果基本一致。因此,在實際檢測時,本研究對國標方法中規定的洗脫條件進行了適當優化,先采用0.8 mmol/L磷酸二氫銨溶液(pH9.0)進行洗脫,再轉換為20 mmol/L磷酸二氫銨溶液(pH8.0)進行洗脫,既可保證五種砷形態化合物實現有效分離,又可在20 min內完成檢測。在上述梯度洗脫條件下,五種砷形態化合物的色譜分離圖譜見圖1。

圖1 五種砷形態化合物混合標準品色譜圖Fig.1 Chromatogram of the mixed standard solutions of the five arsenic compounds

2.2 方法學驗證

2.2.1 檢出限與定量限 五種砷形態化合物的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分析結果見表3。以信噪比S/N=3對應的濃度點作為方法的LOD,以S/N=10對應的濃度點作為方法的LOQ。AsB和MMA的LOD均為0.35 μg/L,LOQ均為1.0 μg/L;AsⅢ、DMA和AsⅤ的LOD均為0.50 μg/L,LOQ均為2.0 μg/L。

表3 五種砷形態化合物的檢出限、定量限、線性范圍與精密度Table 3 LOD,LOQ,linearity range and precision of the five arsenic compounds

2.2.2 線性范圍與精密度 五種砷形態化合物線性范圍與精密度分析結果見表3。結果顯示,在5～200 μg/L濃度范圍內,五種砷形態化合物的峰面積(Y)與濃度(X)均呈現良好的線性關系,R2大于0.999,可以通過外標法實現準確定量。采用50 μg/L的不同砷形態化合物混合標準溶液,重復進樣測定6次,RSD為1.34%～3.97%,方法精密度良好。

2.2.3 加標回收率 為驗證方法的準確度,測定了不同砷形態化合物的加標回收率,結果見表4。在20～100 μg/L加標濃度范圍內,AsB、AsⅢ、DMA、MMA和AsⅤ的回收率在80.2%～113.0%之間。本分析方法的加標回收效果較好,準確度高,可以用于動物臟器組織中不同砷形態化合物的定量分析。

表4 五種砷形態化合物的加標回收率Table 4 Recoveries of the five arsenic compounds

續表

2.3 大鼠臟器中總砷和不同砷形態化合物的含量

不同實驗組大鼠連續灌胃7、30 d后,肝臟和腎臟中總砷和不同砷形態化合物的含量分析結果見表5、表6,砷形態分析圖譜見圖2、圖3。由表5和表6可知,對照組大鼠肝臟總砷含量為1.00～1.16 mg/kg,腎臟總砷含量為1.02～1.07 mg/kg。與對照組相比,連續灌胃7、30 d后,磷蝦油組、砷甜菜堿磷蝦油組大鼠肝臟和腎臟中總砷含量略有升高,但無顯著性差異(p>0.05)。灌胃7 d與灌胃30 d相比較,各實驗組大鼠肝臟和腎臟總砷含量水平均基本一致,無顯著性差異(p>0.05)。

表5 不同實驗組大鼠肝臟中五種砷形態化合物的含量(mg/kg,n=5)Table 5 Contents of the five arsenic compounds in the livers of the experimental rats(mg/kg,n=5)

表6 不同實驗組大鼠腎臟中五種砷形態化合物的含量(mg/kg,n=5)Table 6 Contents of the five arsenic compounds in the kidneys of the experimental rats(mg/kg,n=5)

圖2 磷蝦油組大鼠灌胃30d后腎臟砷形態分析色譜圖Fig.2 Chromatogram of five arsenic compounds in the kidney of the rat fed with krill oil for 30 d

圖3 砷甜菜堿磷蝦油組大鼠灌胃 30d后肝臟砷形態分析色譜圖Fig.3 Chromatogram of five arsenic compounds in the liver of the rat fed with arsenobetaine added krill oil for 30 d

砷形態分析結果顯示,大鼠肝臟和腎臟中主要的砷形態為AsB,約占總砷含量的80%,其次為DMA,而AsⅢ、MMA和AsⅤ均未檢出。連續灌胃7、30 d,磷蝦油組、砷甜菜堿磷蝦油組大鼠肝臟和腎臟中AsB和DMA含量較對照組均無顯著性差異(p>0.05)。灌胃7 d與灌胃30 d相比較,各實驗組大鼠肝臟和腎臟中AsB和DMA含量也無顯著性差異(p>0.05)。由此可見,磷蝦油中的砷甜菜堿在大鼠體內不會產生蓄積作用。

3 討論

砷在自然環境中主要以有機態和無機態兩種形式存在。水產品中砷化合物主要包括AsB、DMA、MMA、砷膽堿(AsC)、砷脂、砷糖等有機砷,以及少量的AsⅢ、AsⅤ等無機砷[13-14]。南極磷蝦中最主要的砷賦存形態為AsB,且其在加工過程中,易隨著醇提、脫溶、精制等過程而富集至磷蝦油中[12,15],含量達到磷蝦油總砷含量的90%以上[10,16]。本研究針對膳食攝入磷蝦油及其砷甜菜堿是否會在體內轉化為無機砷形態,進而引發機體損傷這一科學問題進行了重點考察。研究發現,未給予受試物的大鼠肝臟和腎臟中,砷主要是以AsB和DMA兩種形式存在,其它砷形態特別是毒性較大的無機砷未有檢出。受儀器檢出限以及樣品前處理方法不同等的影響,檢測到的砷形態總量與總砷含量略有差異。大鼠連續攝食南極磷蝦油或添加100 mg/kg砷甜菜堿的南極磷蝦油7 d或30 d后,肝臟和腎臟中總砷、AsB、AsⅢ、DMA、MMA、AsⅤ含量均未有顯著性變化(p>0.05),證明攝入磷蝦油乃至超出正常磷蝦油中砷甜菜堿30倍含量的供試物并不會引發大鼠臟器中砷的蓄積和砷形態間的相互轉化,同時也證明,磷蝦油中其他成分也不會對此代謝過程產生不利影響。前人研究報道,砷甜菜堿具有低毒、不代謝的特點[17],其沒有明顯毒作用的靶器官,不在體內產生蓄積作用[18-20],攝入后主要通過尿液途徑排出體外,小部分隨膽汁等途徑排出,不會在體內代謝轉化為其他形式的砷化合物[21-23],與本文的研究結果保持一致。

歐盟食品安全局在《食品中砷的科學觀點》中指出砷元素的毒性與其存在形態密切相關,無機砷具有致癌毒性,而有機砷通常被認為是低毒或無毒的[15]。以砷化合物的半數致死量LD50(mg/kg)計,其毒性由大到小依次為As(Ⅲ)(14)>As(V)(20)>MMA(200～1800)>DMA(200～2600)>AsC(>6500)>AsB(>10000)[24-25]。郭瑩瑩等[26]基于南極磷蝦油中總砷和無機砷含量的檢測數據,結合南極磷蝦油產品的膳食消費量,通過點評估方法對南極磷蝦油砷膳食暴露量及食用安全性進行了研究,發現攝食南極磷蝦油對無機砷膳食暴露量的貢獻率極低,長期食用磷蝦油并不會增加總膳食無機砷的攝入。綜合以上資料以及本研究的結果可知,長期攝食南極磷蝦油并不會帶來因總砷、無機砷或有機砷含量問題而引發的健康風險。

4 結論

本研究建立了基于HPLC-AFS技術的動物組織臟器中砷形態分析方法,可實現大鼠臟器中AsB、DMA、MMA、AsⅢ、AsⅤ等五種砷形態化合物的定性和定量,五種砷形態的檢出限為0.35～0.50 μg/L,定量限為1.0～2.0 μg/L,方法在5～200 μg/L濃度范圍內線性良好,R2>0.999,加標回收率為80.2%～113.0%,RSD為1.34%～3.97%。該方法具有分離度良好,檢測限低,準確性高等特點。

大鼠肝臟和腎臟中檢出的砷形態化合物主要為AsB和DMA,而AsⅢ和AsⅤ等無機砷形態未有檢出。大鼠肝臟中AsB含量為0.80～0.89 mg/kg、DMA含量為0.18～0.19 mg/kg,腎臟中AsB含量為0.82 mg/kg、DMA含量為0.16～0.18 mg/kg。短期或長期攝食南極磷蝦油及其砷甜菜堿后,臟器中砷形態的組成和含量均未有顯著性變化(p>0.05)。因此,攝食南極磷蝦油不會產生臟器砷蓄積現象,同時,攝入的砷甜菜堿也不會在體內向毒性較強的無機砷形態轉化。南極磷蝦油可以作為安全的食品原料在保健食品、生物醫藥制品領域予以推廣利用。