根系分泌物抑制連作障礙線蟲病的根際調控機制及其應用

劉彤彤，盧巧芳，王男麒，王天琪，劉環環，左元梅

（中國農業大學資源環境學院/國家農業綠色發展研究院/教育部植物-土壤互作重點實驗室，北京 100193）

1 我國農業生產中連作障礙問題突出

連作障礙是指即使在正常的栽培管理措施下，同一片土地連續種植兩茬及以上同種同屬作物而出現病害、缺素，進而大幅減產甚至絕產的現象。連作障礙廣泛存在于大田經濟作物及設施蔬菜、觀賞花卉、果樹等植物生產過程中。連作栽培條件下，根系分泌物在根部連續積累，引起土壤理化性質發生變化[1]，土壤微生物群落結構紊亂[2]，土壤線蟲群落多樣性程度降低[3]。

1.1 連作障礙種植面積和作物比例較高

國外將連作障礙稱為再植病害 (replant disease)。國外地多人少，成熟的現代化耕作技術使國外農場主從源頭主動避免連作障礙[4]，而中國是地少人多型農業大國，耕種模式傳統，各區域有傳統耕種作物，例如新疆的棉花、黑龍江的大豆和馬鈴薯、河南的花生、山東的設施蔬菜、廣東和廣西的香蕉、云南的三七和烤煙，這些特色農產品因當地種植習慣、經濟利益驅使而常年單一種植。

將出現連作障礙的作物分為三大類，包括大田經濟作物 (水稻、大豆和玉米等)、設施園藝作物 (瓜果蔬菜和觀賞花卉) 和中草藥。據中國統計局(2014年)統計，黑龍江省的大田經濟作物輸出量為全國第一，河南和山東分別居第二和第三位。設施園藝作物因大棚自動化越來越高而逐年擴大種植面積，山東、河南、江蘇的蔬菜產量分別居全國的前三位。中草藥的種植面積以湖南省最多，其次為貴州、甘肅。根據各地傳統作物分布和作物輸出量統計分析，發現各省傳統作物有最高輸出量的基本規律。

按照各省耕地面積將各省份連作障礙出現概率分級，根據連作障礙分級情況和三類作物耕地面積所占比例繪制圖1。由圖1可見，黑龍江省、山東省、河南省成為易患且已患連作障礙重災區，其它省份也遭受不同程度的連作障礙，同時大田經濟作物最易患連作障礙。

1.2 連作障礙發生規律呈“拋物線”狀

對比不同作物，發現傳統中藥最易遭受連作障礙，大田經濟作物較耐受連作障礙 (圖2)。根莖類中藥 (三七) 連作2年，重茬幼苗死亡率達100%[5]；香蕉連作10年左右，產量可恢復與非連作蕉園一致[6]；大豆連作15年與連作2年產量無顯著差異[7]；棉田連作20年病情指數最高[8]。分析以上作物在連作條件下，產量開始降低年份、產量最低年份及產量恢復至等同正茬年份的規律 (圖2)，發現連作障礙規律呈“拋物線”狀。作物產量隨連作年限延長而降低，低至最低產量后，作物產量出現回升趨勢，出現自我調節現象。這種連作障礙的自我調節能力受土壤類型、耕種作物、人為施肥等因素的影響而不同。因此，在恰當時機針對性地選擇合理方式解決連作障礙需要大量的研究成果作為理論支持，利用作物連作障礙規律調控作物種植年限是控制連作障礙最直觀的方式。

圖1 中國連作障礙出現概率等級劃分和不同種類作物耕種面積分布示意圖Fig.1 Replant disease levels and percentage of cropping areas of different crops in China

圖2 不同作物長期連作后產量隨連作年限變化規律Fig.2 Regulation of different crop yields with long term continuous cropping years

2 根系分泌物對連作線蟲病具有重要的根際調控作用

2.1 連作作物單一根系分泌物積累易導致連作障礙

連作栽培情況下，單一根系分泌物累積在作物根際，土壤酸化，土壤內線蟲和微生物多樣性均降低，根際生態平衡被打亂，根際有害微生物在酸性條件下大量繁殖，土壤由“細菌型”轉變成“真菌型”，由“健康型”轉變成“致病型”，土壤微生物新陳代謝的整體活性降低，造成土壤酶活性降低，元素發生“木桶效應”；植物寄生線蟲豐度在土壤內大幅上升，廣泛引發線蟲病，且導致復合真菌/細菌病害發生，并連同植物根系分泌的自毒物質一起影響植株代謝，對植物生長有很大的影響，最后導致作物患病，產量降低 (表1)。

2.2 連作造成植物寄生線蟲病害嚴重

連作引起的線蟲病在全國有不同程度地發生。山東壽光是中國蔬菜基地，番茄、黃瓜等設施蔬菜極易感染南方根結線蟲[28]，且于新疆地區發現南方根結線蟲在設施蔬菜土壤中為優勢種[29]。云南三七易遭受北方根結線蟲侵染，導致三七品質和產量降低[30]。南方根結線蟲 (Meloidogyne incognita)、爪哇根結線蟲 (Meloidogyne javanica)、花生根結線蟲(Meloidogyne arenaria) 和北方根結線蟲 (Meloidogyne hapla) 占根結線蟲屬的95%，其中南方根結線蟲M.incognita占比最多，分布最為廣泛[31]。孢囊線蟲可毀滅性危害甜菜、大豆及水稻等。在大豆生產國均有大豆孢囊線蟲病發生，使大豆減產5%～20%，甚至絕產，我國每年受害面積達2.67 × 106hm2，危害程度和面積逐年發展。

植物寄生線蟲是最具破壞性的植物病原之一，宿主范圍大于3000種作物，線蟲侵染加重作物根腐病、枯萎病、立枯病等，致使全球每年損失達157億美元[32]，因此防治線蟲病害任務日益加重。

2.3 防控線蟲病的關鍵方法和措施

防治線蟲病的方法包括化學、物理、農業和生物方法 (圖3)。使用化學殺線劑污染環境易殘留，采用熱、電消毒的物理方法繁瑣不持續，間作、輪作等不適用于所有農作物，而間作、輪作體系中所發現的特殊根系分泌物，配置成生物源功能肥料的生物方法才是發展可持續農業的最佳選擇。未來開發植物源殺線蟲功能物質進行根際調控是研究的熱點之一，根際調控作為一種新的農業技術手段[33]，對農業生產起著日益重要的作用，利用抗性植物和非寄主植物根系分泌物或特殊作物殘茬提取物，結合有益微生物配制生物功能肥料 (bio-fertilizer)，進行根際調控可高效緩解連作障礙。

表1 不同作物連作障礙因素、自毒物質、嚴重年限及表現Table 1 Factors, autotoxic substance, serious years and performance of different crops of catched replant diseases

3 利用根系分泌物介導實現對線蟲識別和侵染的抑制

3.1 根系分泌物在植物根際的生理生態調控作用

根系分泌物是根系在生命活動過程中由根組織向土壤中持續釋放化合物的總稱。根系分泌物包括：離子、氨基酸、酰胺類、糖類、有機酸、酚酸類，及多種次級代謝物[34]。在根際土壤中，根系分泌物與土壤生物互作，植物既可調節其根際化學組成來促進微生物的生長，從而提高其在特定生態系統中的適應性[35]；也可因微生物代謝對底物的偏好改變植物根系分泌物組成[36]。長期連作，單一根系分泌物積累于根際，造成特異微生物、線蟲富集，從而引起連作微生物病害、線蟲病害，甚至復合病害。但抗性植物和非寄主植物的根系分泌物在抵御病原菌和植物寄生線蟲方面表現出較好的前景。

通過GC-MS (氣相色譜-質譜聯用儀)、X射線CT (電腦斷層掃描) 和MRI (磁共振成像) 可視化技術鑒定根系分泌物[37]，利用特殊根系分泌物對根結線蟲進行根際調控能夠為線蟲防治提供理論依據，還可土壤生物-植物間互作提供新的認知。結合分子手段對土壤微生物測序，通過基因功能預測了解微生物對代謝物底物偏好，進而調控根際微生物群落組裝模式，可改善作物根際微生態環境。同時了解線蟲如何識別寄主，掌握不同根系分泌物對線蟲的根際調控效果及其機制將有效防治線蟲病害；線蟲群落結構及多樣性分析也已進入分子分析階段，為連作線蟲病害的分析和治理提供了科學的理論基礎[38]。

圖3 防治連作障礙線蟲病的關鍵方法和措施Fig.3 Selection of methods for controlling replant nematode disease

3.2 線蟲依靠根系分泌物識別寄主

線蟲生命周期有6個階段：卵―幼蟲 (J1、J2、J3和J4)―成蟲。線蟲從卵發育到J1、J2時期尋找合適的根系寄生，僅在 J2 時期通過頭部兩側對稱的化感器及側腹尾感器[39]受寄主根系分泌物的刺激[40]具備侵染能力 (圖4)。

當根結屬J2幼蟲靠近寄主植物時，線蟲食道腺分泌蛋白降解根細胞細胞壁，線蟲進入根內，食道腺分泌分泌物使導管細胞膨脹并加快周圍細胞分裂，從而形成巨型細胞，最終形成根結。南方根結線蟲在溫度20～30℃和濕度40%～70%時完成一個世代約需30～60天，在適宜的環境條件下，根結線蟲每年可形成5～10世代。南方根結線蟲以幼蟲在土中和卵在病根的根結內休眠越冬，次年氣溫升到10℃左右時，越冬卵開始孵化成為幼蟲進入土壤，進入土壤的J2幼蟲尋找寄主植物，完成侵染。

圖4 利用根系分泌物結合根結線蟲發育關鍵時期控制線蟲病害機理圖Fig.4 Mechanism of root exudates-mediated root knot nematode disease

孢囊屬J2幼蟲穿刺進入根中，從寄主根系幼嫩組織侵入皮層直到中柱，18 天后雌成蟲身體膨大，卵巢中充滿卵[41]。當寄主根系衰老，卵囊中的卵不再孵化，雌蟲死亡，體壁硬化，轉變成孢囊，成熟孢囊脫落于土中而成為再侵染源。有報道稱，大豆孢囊線蟲雌雄交配會發生基因交換，即使種植單一抗性品種，也可能造成同一群體中弱勢小種變異為優勢小種，即引起生理小種致病性變異，從而使該作物抗性喪失[42]。因此，選擇持續長久的防治方法非常重要。

有大量研究證明，易感作物根系分泌物使線蟲產生趨向性，促進蟲卵孵化。易感大豆根系分泌的谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸和苯丙氨酸可吸引大豆孢囊線蟲[43]；柑橘根系分泌的α-松萜、檸檬烯和β-松萜等萜類物質可吸引柑橘根結線蟲[44-45]。

3.3 根系分泌物調控線蟲識別、侵染的生物學機制

植物根際與線蟲互作，具有侵染能力的J2幼蟲具有一系列可以響應根系分泌物活性物質的嗅覺神經元。因此，通過破壞J2幼蟲向寄主植物的趨向性及運動，是減輕線蟲病害的有效措施之一，線蟲的二齡期成為化學信號調控的重要時期。

南方根結線蟲中42.1%基因與秀麗線蟲是直系同源基因，這些基因與根結線蟲的生育相關，成為藥物防治的靶基因[46]。FMRFamide-like peptides(FLPs) 是根結線蟲最大神經遞質之一，“FLP作為重要的信號傳導途徑之一”已在植物與線蟲的互作過程中取得巨大進展。FLP信號途徑與G-蛋白偶聯受體 (G-protein coupled receptors GPCR 亞類型X1-X5) 相關，啟動下游第二信使，控制根結線蟲運動、取食、肌肉組織的再生及神經調節[47]。

孢囊線蟲的Ror毒力基因可控制線蟲產生纖維素酶和果膠裂解酶裂解植物根系細胞壁，進而通過Hg-rbp-2控制線蟲的發育和寄生能力[48]，但孢囊線蟲雌雄交配產生后代會發生基因交換使線蟲生理小種發生變化[49]，因此針對孢囊線蟲越來越需要尋找新的抗性基因或擴展抗性背景。

3.4 植物根系分泌物通過根際調控抑制線蟲侵染的實踐應用

易感作物根系分泌物促進線蟲趨向運動和孵化，大豆根系分泌物促進孢囊線蟲的孵化，且連作時間越長，大豆患孢囊線蟲病越嚴重[50]；花生根系分泌物影響土壤線蟲豐度，分泌物濃度越高，土壤線蟲多樣性越低[51]。然而，非寄主作物根系分泌物可調控線蟲趨向性，抑制卵孵化或致死線蟲。董林林等在茼蒿、蓖麻與番茄間作體系中發現茼蒿根系分泌物中月桂酸，蓖麻根系分泌物中棕櫚酸和亞油酸對根結線蟲有致死效應、抑制線蟲孵化，并且在低濃度下吸引線蟲殺死線蟲，高濃度下趨避線蟲[52]。掌握月桂酸、亞油酸和棕櫚酸調控Mi-16D10和Mi-flp-18基因表達來抑制線蟲侵染與繁殖，從而減輕作物根結線蟲病害。鐘麗娜發現仙客系列抗性品種番茄的特異根系分泌物濃度大于4 mmol/L時能將25.9%以上的線蟲致死，且濃度越高致死能力越強，在低濃度時可抑制線蟲的運動能力[53]。選擇抗性品種間套作即是利用根系分泌物進行根際調控的原理，調動根際有益微生物，抑制寄生線蟲防治連作障礙。同時，特殊植物殘渣再利用也可實現根際調控，青蒿、萬壽菊、薄荷、紫花苜蓿等幾種植物提取物能夠有效防治根結線蟲[54-55]。但直接施用植物殘渣使作物產量降低[56]，可將殘渣提取物添加至腐熟堆肥，既可抑制線蟲病又可實現作物增產[57]。

利用根系分泌物和特殊作物殘渣提取物作為生物源功能物質，配置成生物功能肥料 (bio-fertilizer)進行根際調控，是高效控制連作障礙線蟲病害和發展可持續農業的重要手段 (圖5)。

4 展望

我國連作障礙現象普遍，單一作物長期耕種，根系分泌物在根際單一積累，擾亂根際微生物群落結構，富集植物寄生線蟲。在我國廣泛引起線蟲病是作物連作中最難治理的土傳病害之一。

基于近年來最新的國內外研究進展，針對植物根系分泌物在控制寄生線蟲識別侵染植物過程中具有重要的生物學調控作用，面對我國農業生產中作物連作障礙突出的問題，應該在以下幾個方面引起重視和突破：1) 針對重要和特定的作物，掌握作物連作發病規律，找到防治連作障礙的關鍵時期。2)圍繞根系分泌物與線蟲互作關系探索克服連作線蟲病害的方法，為實際生產應用提供最有效的理論依據和技術支撐。3) 篩選抗性植物和非寄主植物特異根系分泌物作為生物源功能物質，為創建無公害植物源殺線劑提供重要依據。同時發揮生態位優勢功能微生物、營養調控和土壤外源添加物的根際綜合調控，致力于改善土壤微生態環境，克服線蟲引起的連作障礙；也可通過分子生物學技術手段監測線蟲多樣性變化，科學評價不同生態系統的土壤質量。最終，在控制線蟲方面揭示植物和線蟲在根際間信號傳遞的分子和生理機制的新信息，發展有效且可持續的控制策略，實現一套全面集成和優化的方法來提高作物產量和營養品質的同時降低作物線蟲病；在土壤質量指示生物中實現植物-寄生蟲相互作用的整體表達分析，完整評估基于改變土壤線蟲群落結構多樣性和土壤質量之間的關系。

圖5 根系分泌物介導的根際調控克服連作障礙線蟲病的生物學機制及其應用Fig.5 Rhizosphere regulatory mechanism of bio-fertilizer reducing replant nematode disease

總之，在理論層面明確以根系分泌物為主導，調控連作障礙的生物學機制的基礎上，進一步科學定向調控植物根際的生物學過程，發揮植物-土壤-微生物體系優勢互補的生物學潛力，這將對提升土壤健康和促進作物優質高產高效并實現綠色農業和可持續發展具有重要的理論和實踐意義，應用前景廣闊。