亞甲基藍(lán)與DNA鏈結(jié)合的太赫茲光譜研究

李早霞，衣文索，顏?zhàn)R涵，王化斌

（1.長(zhǎng)春理工大學(xué) 光電工程學(xué)院，長(zhǎng)春 130022；2.中國(guó)科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院，重慶 400714）

脫氧核糖核酸（DNA）是由兩條鏈（由核苷酸組成）組成的分子，它們彼此纏繞以形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，攜帶著生物生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖的遺傳指令。目前生物體內(nèi)與藥物作用的三種主要靶向分子分別為酶、受體及核酸，其中以酶和受體為靶的藥物設(shè)計(jì)開(kāi)始較早，而以核酸為靶的藥物研究則起步較晚［1］。研究DNA與藥物小分子之間的相互作用將有助于理解某些藥物分子對(duì)DNA復(fù)制及轉(zhuǎn)錄的影響［2］；有助于闡明一些致癌物質(zhì)或者一些抗腫瘤、抗病毒藥物的作用機(jī)制，幫助人們了解某些疾病的發(fā)病機(jī)制和藥物的治病機(jī)理；有助于發(fā)現(xiàn)和篩選新型小分子藥物。

目前，已經(jīng)有許多技術(shù)用于研究小分子與DNA之間的相互作用，如光譜方法、電泳和電化學(xué)方法、核磁共振技術(shù)和微量熱法等［3］。其中光譜方法如熒光光譜、紅外光譜、拉曼光譜等作為物理方法，具有良好的應(yīng)用前景。這些技術(shù)的開(kāi)發(fā)和發(fā)展促進(jìn)了新藥的發(fā)現(xiàn)，并在臨床治療的研究和應(yīng)用方面取得了很大進(jìn)展。但熒光光譜需要標(biāo)記分子，可能會(huì)導(dǎo)致觀察到的現(xiàn)象中包含非目標(biāo)分子信息［4］；而紅外光譜主要反應(yīng)官能團(tuán)的信息，對(duì)分子整體構(gòu)象變化不敏感，不適用于非共價(jià)鍵結(jié)合模式；拉曼光譜由于需要激光激發(fā)，極易導(dǎo)致被測(cè)樣品的損壞，影響測(cè)試的準(zhǔn)確性［5］。因此，不斷研究新型檢測(cè)技術(shù)是發(fā)展藥物開(kāi)發(fā)的必要手段。開(kāi)發(fā)快速、靈敏的技術(shù)來(lái)研究DNA和藥物之間的相互作用，可以為進(jìn)一步加快藥物開(kāi)發(fā)的過(guò)程提供技術(shù)支持。

基于飛秒脈沖激光的太赫茲時(shí)域光譜檢測(cè)技術(shù)能夠做到對(duì)待測(cè)對(duì)象高靈敏、無(wú)損傷的檢測(cè)。太赫茲波通常是指頻率范圍在0.1THz～10THz內(nèi)的電磁波，其在電磁波波譜中介于微波和紅外輻射之間，處于由電子學(xué)向光子學(xué)過(guò)渡的區(qū)域。很多生物大分子的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)以及晶體中晶格的振動(dòng)吸收均對(duì)應(yīng)于太赫茲波段。藥物小分子與DNA相互作用的主要作用模式之一是非共價(jià)鍵結(jié)合，太赫茲光譜能夠表征非共價(jià)鍵作用，包括分子內(nèi)和分子間的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)、氫鍵和范德華力［6］，所以太赫茲光譜在檢測(cè)小分子藥物方面具有很大潛力。在被測(cè)對(duì)象的不同狀態(tài)和反應(yīng)過(guò)程中，通過(guò)分析太赫茲波段內(nèi)獨(dú)特指紋特征的變化，可以研究化學(xué)和生物分子、化合物的構(gòu)象和結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)信息。

亞甲基藍(lán)（MB）已被證明通過(guò)非共價(jià)鍵作用與DNA發(fā)生強(qiáng)烈相互作用［7］。MB首先由Heinrich Caro于1876年制備，它是一種化學(xué)式為C16H18N3SCl的雜環(huán)芳香族化合物，已被廣泛用于生物和化學(xué)領(lǐng)域［8］。實(shí)驗(yàn)以亞甲基藍(lán)為例，測(cè)試了其單組分及與雙鏈DNA（來(lái)源于玉米基因組DNA）及單鏈DNA（來(lái)源于鮭魚(yú)精）物理混合和溶解結(jié)晶的太赫茲光譜。當(dāng)MB與雙螺旋DNA以溶解結(jié)晶的方式結(jié)合后，水合MB的特征吸收峰消失；而簡(jiǎn)單的物理混合則不會(huì)造成這一現(xiàn)象。MB水合物光譜中太赫茲特征吸收峰的保留或消失表明了物理或化學(xué)變化的差異。以此可以確定藥物小分子與DNA是否發(fā)生了相互作用。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 樣品制備

亞甲基藍(lán)水合物（CAS號(hào)7220-79-3）和單鏈DNA（CAS號(hào)438545-06-3）購(gòu)自Aladdin（中國(guó)上海）。實(shí)驗(yàn)中其它所用溶劑均購(gòu)自SCR（中國(guó)上海）。快速DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。亞甲基藍(lán)水合物及無(wú)水合物參照?qǐng)?bào)道的重結(jié)晶方法制備［8］。雙鏈DNA來(lái)源于參照標(biāo)準(zhǔn)方案從玉米葉組織中純化的基因組DNA。物理混合物的獲得是通過(guò)使用渦旋混合器在玻璃小瓶中以質(zhì)量比為1∶1的比例輕輕混合。溶解結(jié)晶是通過(guò)在不同材料比例的H2O水溶液中37℃重結(jié)晶，隨后在室溫和高濕環(huán)境下暴露24小時(shí)以上。然后使用手動(dòng)壓片機(jī)壓制直徑為15.0mm，厚度為約1.0mm的樣品進(jìn)行測(cè)量。

1.2 太赫茲光譜儀

太赫茲時(shí)域光譜技術(shù)（Terahertz time-domain spectroscope，THz-TDS）是利用太赫茲脈沖在樣品表面發(fā)生反射或透射過(guò)樣品后所產(chǎn)生的太赫茲時(shí)域信號(hào)，然后經(jīng)過(guò)傅里葉變換獲得頻域上的振幅及相位的變化［9］。

實(shí)驗(yàn)使用Picometrix T-ray 5000光纖耦合光譜儀（Advanced Photonix，Inc.，MI，USA）以透射模式進(jìn)行太赫茲光譜測(cè)量。光譜儀使用飛秒激光脈沖和LT-InGaAs光電導(dǎo)天線來(lái)生成相干探測(cè)時(shí)域系統(tǒng)中超短太赫茲脈沖電場(chǎng)。T-ray 5000裝置原理圖如圖1所示，飛秒脈沖激光器發(fā)出的激光（中心波長(zhǎng)1064nm，重復(fù)頻率100MHz）經(jīng)過(guò)激光分束鏡分為兩路，一路為泵浦激光，另一路為探測(cè)激光。泵浦激光激發(fā)光電導(dǎo)發(fā)射天線輻射出太赫茲波，然后太赫茲波經(jīng)左右對(duì)稱的一對(duì)高阻硅透鏡后照射到光電導(dǎo)探測(cè)天線。在此過(guò)程中，通過(guò)光學(xué)延遲線改變探測(cè)激光和泵浦激光之間的光程差實(shí)現(xiàn)時(shí)域等效采樣而得到完整的太赫茲時(shí)域信號(hào)［10］。對(duì)太赫茲時(shí)域波形進(jìn)行傅里葉變換可以得到該電磁脈沖在頻率域的分布。

太赫茲光譜測(cè)量環(huán)境均在溫度21.0±0.4℃，相對(duì)濕度＜2.0%條件下進(jìn)行。

圖1 T-ray 5000裝置原理圖

2 結(jié)果與討論

2.1 亞甲基藍(lán)的太赫茲光譜特征

水合是水分子在物質(zhì)中存在的一種重要形式，分子的水合常常會(huì)引起其物質(zhì)性質(zhì)的變化。五水MB及無(wú)水MB在0.2～2.0THz的太赫茲吸收光譜顯示如圖2所示，MB五水合物的太赫茲吸收光譜在位于0.85THz和1.62THz有明顯的特征吸收峰；而無(wú)水MB在測(cè)量光譜范圍內(nèi)則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)特征吸收峰。

圖2 亞甲基藍(lán)的太赫茲光譜特征

結(jié)果表明MB五水合物和MB無(wú)水合物的太赫茲吸收特征與MB分子的結(jié)晶狀態(tài)及相互作用有關(guān)。在咖啡因的太赫茲光譜中也觀察到由結(jié)晶水變化及分子相互作用改變引起的太赫茲吸收光譜的差異［11］。

2.2 亞甲基藍(lán)與DNA不同結(jié)合方式下的太赫茲吸收光譜

小分子藥物與DNA的特異性結(jié)合，在基因表達(dá)的調(diào)控過(guò)程及很多抗癌藥物的體內(nèi)作用方式的研究中非常重要［1］。為了獲得小分子藥物MB與DNA不同結(jié)合方式下的太赫茲吸收光譜，實(shí)驗(yàn)又分別測(cè)試了五水MB和DNA在溶解結(jié)晶和物理混合狀態(tài)下的太赫茲光譜，結(jié)果如圖3所示。溶解結(jié)晶的太赫茲吸收光譜失去了0.85THz和1.62THz頻率下的特征吸收峰，而在物理混合物和單個(gè)組分中均存在這兩處頻率下的吸收峰。因?yàn)槲锢砘旌虾驧B與DNA分子間作用的距離還不足以達(dá)到產(chǎn)生非共價(jià)鍵結(jié)合，所以保留了各自的特征吸收峰；而溶解能幫助分子間產(chǎn)生非共價(jià)鍵結(jié)合，使得表征MB原構(gòu)象特征的特征吸收峰消失。MB水合物光譜中太赫茲特征吸收峰的保留或消失表明了物理或化學(xué)變化的差異。以此可以確定藥物小分子與DNA是否發(fā)生了相互作用。

有研究表明，單鏈DNA在分子力學(xué)性質(zhì)、吸收光譜、堿基反應(yīng)性質(zhì)等方面都和雙鏈DNA不同［12］。實(shí)驗(yàn)又分別對(duì)五水MB和單、雙鏈DNA進(jìn)行了太赫茲光譜檢測(cè)。圖3（a）表明檢測(cè)MB水合物與單鏈DNA無(wú)論物理混合或是溶解后再結(jié)晶，其產(chǎn)物的太赫茲吸收光譜中都包含兩個(gè)特征吸收峰；圖3（b）表明檢測(cè)MB水合物與雙鏈DNA的物理混合物時(shí)，這些太赫茲光譜特征仍然存在。而檢測(cè)MB水合物與雙鏈DNA結(jié)合形成的溶解結(jié)晶時(shí)，MB水合物太赫茲吸收光譜中的吸收峰消失。物理混合后由于各組分間空間距離不足以引發(fā)物質(zhì)間相互作用，混合物的光譜特征源于各組分各自信息的疊加［13］，MB與DNA物理混合同MB水合物的太赫茲特征吸收峰位置基本相同；而溶解可提供各組分發(fā)生相互作用的條件，但MB與單鏈DNA溶解結(jié)晶后依然具有同MB水合物相同位置的太赫茲特征吸收峰，說(shuō)明這個(gè)體系內(nèi)的MB水合物未發(fā)生構(gòu)象變化，而與雙鏈DNA溶解結(jié)晶后特征吸收峰消失說(shuō)明MB同雙鏈DNA發(fā)生了反應(yīng)。溶液中，MB與雙鏈DNA發(fā)生非共價(jià)鍵結(jié)合［14］。MB與雙鏈DNA兩者的相互作用會(huì)引發(fā)MB水合物構(gòu)象的變化，使其失去了原本的太赫茲特征吸收峰。

圖3 MB水合物與DNA相互作用的太赫茲吸收光譜

眾所周知，共結(jié)晶是由于兩種或多種不同組分分子之間的分子間氫鍵、非離子鍵或其他非共價(jià)鍵相互作用而產(chǎn)生的。MB可以與雙鏈DNA相結(jié)合，該結(jié)果意味著形成的共結(jié)晶改變了MB的組成和分子間或分子內(nèi)的相互作用，這與單親組分的晶格顯著不同。因此，在這些光譜中觀察到的特征吸收峰的消失是由于分子間非共價(jià)鍵結(jié)合使得MB水合物失去了原有的光譜特征。

2.3 亞甲基藍(lán)與DNA不同濃度結(jié)合的太赫茲吸收光譜

太赫茲吸收光譜特征吸收峰振幅的高低可以反應(yīng)對(duì)應(yīng)物質(zhì)的量的多少，圖4是DNA與MB在1∶1、2∶1、4∶1這三種濃度比例下，對(duì)溶解后的析出物的檢測(cè)結(jié)果。

圖4 DNA與MB不同濃度比例的結(jié)合

圖4（a）中是單鏈DNA與MB不同濃度比例的混合。由圖中可以看出，單鏈DNA與MB以1∶1濃度混合時(shí)，太赫茲特征吸收峰的峰值最大，隨著DNA與MB濃度比例的增大，相應(yīng)的特征吸收峰的相對(duì)高度明顯降低。MB與單鏈DNA混合降低了檢測(cè)物中MB的相對(duì)含量，使得特征吸收峰降低。圖4（b）是雙鏈DNA與MB不同濃度比例的結(jié)合，由圖3已經(jīng)知道，MB水合物與雙螺旋DNA結(jié)合會(huì)使其失去特征吸收峰。MB水合物與雙螺旋DNA濃度比例在4∶1、2∶1的時(shí)候沒(méi)有特征吸收峰，可以判斷MB已反應(yīng)完全；濃度比例的結(jié)合是1∶1的時(shí)候還存在一個(gè)小的吸收峰，是由于還有部分MB水合物沒(méi)有結(jié)合完，所以留存了部分痕跡。說(shuō)明這種雙鏈DNA與MB反應(yīng)完全的濃度比例在1∶1和2∶1之間。

3 結(jié)論

通過(guò)采用太赫茲吸收光譜法檢測(cè)亞甲基藍(lán)（MB）與雙螺旋DNA之間的相互作用，提供了利用太赫茲光譜檢測(cè)小分子藥物的實(shí)例。MB水合物與單鏈DNA溶解結(jié)晶后由于未發(fā)生相互作用反應(yīng)，沒(méi)有導(dǎo)致MB構(gòu)象的變化；伴隨著與雙鏈DNA溶解結(jié)晶后造成的MB構(gòu)象的變化，MB水合物的太赫茲光譜特征峰消失。說(shuō)明可以通過(guò)監(jiān)測(cè)反應(yīng)物與產(chǎn)物太赫茲吸收光譜的變化判斷小分子藥物與DNA是否發(fā)生了相互作用，為篩選小分子藥物提供了一種無(wú)標(biāo)記檢測(cè)新方法。