轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉對(duì)根際土壤Bt蛋白殘留和速效養(yǎng)分含量的影響

陳彥君，任夢(mèng)云，關(guān) 瀟，朱文娟，沈 奇

(1. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院，北京 100012；2. 海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，海南 海口 570228；3. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所, 浙江 杭州 310021)

棉花不僅是我國(guó)種植面積最大的轉(zhuǎn)基因作物，更是全球性的主要經(jīng)濟(jì)作物和纖維作物，自其廣泛種植以來(lái)，為社會(huì)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)效益[1]，但與此同時(shí)，其對(duì)生態(tài)環(huán)境的潛在安全風(fēng)險(xiǎn)也越來(lái)越多地受到全球關(guān)注[2-3]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉環(huán)境安全評(píng)價(jià)的研究主要集中在基因漂移、對(duì)土壤微生物數(shù)量種類和結(jié)構(gòu)的影響、對(duì)非靶標(biāo)動(dòng)物的影響、對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響等方面。Chen等[4]的研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是Bt棉種植還是殘基摻入，均對(duì)土壤微生物有顯著抑制作用。沈法富等[5]在基因漂移方面進(jìn)行了較為深入的研究：陸地棉在距離<6 m時(shí)，基因漂移發(fā)生的頻率較高，但隨著種間距離的增加，發(fā)生基因漂移的頻率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，且當(dāng)種間距離達(dá)到36 m時(shí)，基因漂移發(fā)生的概率幾乎為0；海島棉在種間距離需達(dá)到72 m才可避免基因漂移的發(fā)生。Wilson等[6]通過(guò)田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉會(huì)因?yàn)閷?duì)鱗翅目害蟲(chóng)的顯著影響而對(duì)甘薯白粉虱產(chǎn)生間接影響，造成其種群的增長(zhǎng)。

土壤生態(tài)系統(tǒng)是轉(zhuǎn)基因作物外源基因及其產(chǎn)物表達(dá)的重要場(chǎng)所，在作物生長(zhǎng)過(guò)程中，根系分泌是Bt蛋白進(jìn)入土壤的重要方式，土壤生態(tài)系統(tǒng)中特定生物功能類群都有可能因此發(fā)生改變。速效養(yǎng)分是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中必不可少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可直接參與土壤的生物化學(xué)轉(zhuǎn)化過(guò)程[7]，是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)。本文以轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉為研究對(duì)象，重點(diǎn)討論其對(duì)根際土壤Bt蛋白殘留及根際土壤速效養(yǎng)分含量的影響，為轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的環(huán)境安全評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

試驗(yàn)地位于山東省高青縣棉花種植示范基地，地理位置為118°00′N，37°09′E，屬于溫帶性季風(fēng)氣候，年平均氣溫為11～14℃，年平均降水量598.1 mm，平均蒸發(fā)量為1 589.4 mm。全年無(wú)霜期180～200 d，光熱資源豐富，年日照時(shí)數(shù)2 300～2 900 h。4個(gè)品種轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉及其對(duì)照常規(guī)棉種植環(huán)境一致。

1.2 供試材料

供試棉花為轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉魯棉研28號(hào)及其對(duì)照常規(guī)棉CK1；魯棉研36號(hào)及其對(duì)照常規(guī)棉CK2；山農(nóng)棉8號(hào)及其對(duì)照常規(guī)棉CK3；鑫秋4號(hào)及其對(duì)照常規(guī)棉CK4。試驗(yàn)于2016年5-8月進(jìn)行，水肥管理采用常規(guī)管理。

1.3 樣品采集

試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。分別在各塊棉田棉花生長(zhǎng)的苗期、蕾期、花鈴期、吐絮期進(jìn)行土壤樣品采集。按五點(diǎn)取樣法混合取樣，同時(shí)避開(kāi)道路等可能影響因素。采樣時(shí)去除表面雜草，用“抖根法”取根際土壤，用冰盒保存，帶回實(shí)驗(yàn)室。一部分土樣保存于-80℃，進(jìn)行土壤Bt蛋白殘留量檢測(cè)；一部分土樣自然風(fēng)干，過(guò)1.00 mm篩，進(jìn)行速效養(yǎng)分含量的檢測(cè)。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1Bt蛋白殘留的測(cè)定 采用美國(guó)Envirologix公司的ELISA試劑盒，測(cè)定棉花根際土壤的Bt蛋白殘留量。

1.4.2 土壤養(yǎng)分含量的測(cè)定 土壤養(yǎng)分的測(cè)定參照鮑士旦方法進(jìn)行[8]：硝態(tài)氮含量的測(cè)定采用紫外分光光度法，銨態(tài)氮含量的測(cè)定采用靛酚藍(lán)比色法，速效磷含量的測(cè)定采用鉬銻抗比色法。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD多重比較分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生育期轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉根際土壤中Bt蛋白含量

4個(gè)品種轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉根際土壤Bt蛋白殘留量在各生育期均顯著高于對(duì)照常規(guī)棉(P<0.05，圖1)，且在整個(gè)生長(zhǎng)期呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，蕾期蛋白殘留量達(dá)到最大。魯棉研28號(hào)在苗期、蕾期、花鈴期、吐絮期分別顯著高于其對(duì)照常規(guī)棉427.94%，1029.66%，661.15%，353.98%。魯棉研36號(hào)在苗期、蕾期、花鈴期、吐絮期分別顯著高于其對(duì)照常規(guī)棉393.24%、2573.45%、638.10%、885.53%。山農(nóng)棉8號(hào)在苗期、蕾期、花鈴期、吐絮期分別顯著高于其對(duì)照常規(guī)棉1 208.89%、717.94%、836.36%、264.76%。鑫秋4號(hào)在苗期、蕾期、花鈴期、吐絮期分別顯著高于其對(duì)照常規(guī)棉423.10%、764.74%、793.18%、342.43%。

2.2 轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉根際土壤速效養(yǎng)分含量

2.2.1 轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉根際土壤硝態(tài)氮含量 4個(gè)品種轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉及其對(duì)照常規(guī)棉在整個(gè)生長(zhǎng)期根際土壤硝態(tài)氮含量均表現(xiàn)為苗期最高，吐絮期最低(圖2)。魯棉研28號(hào)在苗期低于對(duì)照常規(guī)棉18.32%，在蕾期低于對(duì)照常規(guī)棉5.98%，在花鈴期高于對(duì)照常規(guī)棉5.50%(P<0.05)，在吐絮期與對(duì)照常規(guī)棉差異不顯著(P>0.05)；魯棉研36號(hào)在苗期顯著低于對(duì)照常規(guī)棉2.66%，在花鈴期顯著高于對(duì)照常規(guī)棉5.50%，在蕾期、吐絮期與對(duì)照常規(guī)棉差異不顯著；山農(nóng)棉8號(hào)在苗期顯著低于對(duì)照常規(guī)棉16.78%，在蕾期顯著低于對(duì)照常規(guī)棉10.23%，在花鈴期、吐絮期與對(duì)照常規(guī)棉差異不顯著；鑫秋4號(hào)及其對(duì)照常規(guī)棉在苗期、花鈴期、吐絮期差異不顯著，僅在蕾期顯著低于對(duì)照常規(guī)棉8.74%。

2.2.2 轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉根際土壤銨態(tài)氮含量 4個(gè)品種轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉及對(duì)照常規(guī)棉整個(gè)生長(zhǎng)期的根際土壤銨態(tài)氮含量均呈下降趨勢(shì),表現(xiàn)為苗期含量最高，吐絮期含量最低(圖3)。魯棉研28號(hào)在蕾期顯著低于對(duì)照常規(guī)棉11.51%，在花鈴期顯著低于對(duì)照常規(guī)棉28.22%，在苗期、吐絮期與對(duì)照常規(guī)棉差異不顯著；魯棉研36號(hào)在蕾期顯著低于對(duì)照常規(guī)棉15.22%，在花鈴期顯著低于對(duì)照常規(guī)棉26.52%，在苗期、吐絮期與對(duì)照常規(guī)棉差異不顯著；山農(nóng)棉8號(hào)根際土壤銨態(tài)氮含量在各生育期均低于對(duì)照常規(guī)棉，其在蕾期顯著低于對(duì)照常規(guī)棉12.57%，在花鈴期顯著低于對(duì)照常規(guī)棉25.50%，在苗期、吐絮期與對(duì)照常規(guī)棉差異不顯著；鑫秋4號(hào)在蕾期、花鈴期分別顯著低于對(duì)照常規(guī)棉3.47%和21.53%，在吐絮期顯著高于對(duì)照常規(guī)棉6.22%，在苗期與對(duì)照常規(guī)棉差異不顯著。

注：直方柱上方標(biāo)不同字母表示差異顯著水平(P<0.05)，下同。Note: The different letters above the straight square column indicate significant difference (P<0.05), the same below.圖1 轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉根際土壤Bt蛋白殘留量Fig.1 Residues of Bt protein in rhizosphere soil of transgenic Bt cotton

圖2 轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉根際土壤硝態(tài)氮含量Fig.2 The content of nitrate nitrogen in transgenic Bt cotton rhizosphere soil

圖3 轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉根際土壤銨態(tài)氮含量Fig.3 The content of ammonium nitrogen in transgenic Bt cotton rhizosphere soil

2.2.3 轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉根際土壤速效磷含量 在棉花的整個(gè)生長(zhǎng)期，4個(gè)品種轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉及其對(duì)照常規(guī)棉根際土壤速效磷含量均呈上升趨勢(shì)，表現(xiàn)為苗期含量最低，吐絮期含量最高(圖4)。魯棉研28號(hào)根際土壤速效磷含量始終高于對(duì)照常規(guī)棉，其在蕾期和吐絮期分別顯著高于對(duì)照常規(guī)棉10.29%和8.59%，在苗期、花鈴期與對(duì)照常規(guī)棉差異不顯著；魯棉研36號(hào)在苗期顯著高于對(duì)照常規(guī)棉6.77%，在蕾期、花鈴期、吐絮期均與對(duì)照常規(guī)棉差異均不顯著；山農(nóng)棉8號(hào)、鑫秋4號(hào)在4個(gè)生育期均與對(duì)照常規(guī)棉差異不顯著。

圖4 轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉根際土壤速效磷含量Fig.4 The content of available phosphorus in transgenic Bt cotton rhizosphere soil

3 討 論

研究結(jié)果顯示，4個(gè)品種轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉根際土壤中Bt蛋白殘留量在整個(gè)生長(zhǎng)期均呈先升高后降低的趨勢(shì)，且均顯著高于對(duì)照常規(guī)棉。這與許多專家學(xué)者研究結(jié)果較為一致[9-12]，但也有研究得出了不同的結(jié)果，如張莉等[13]檢測(cè)不同地區(qū)不同生育期Bt-SY63稻田土壤Bt蛋白的殘留，大部分都未檢測(cè)到Bt蛋白。劉蔸蔸[14]檢測(cè)經(jīng)3種不同方法處理過(guò)的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉土壤，均未檢測(cè)到Bt蛋白的殘留。造成試驗(yàn)結(jié)果差異的原因可能有：試驗(yàn)所用ELISA試劑盒不同，其對(duì)蛋白的檢測(cè)限不同，低于檢測(cè)限的濃度都不能被準(zhǔn)確檢測(cè)；試驗(yàn)選用的棉花品種不同，Bt蛋白的表達(dá)規(guī)律也不盡相同[11]；試驗(yàn)地不同，土壤微生物組成、土壤水分和環(huán)境條件等均可能影響土壤中Bt蛋白的降解；土壤粒徑成分不同，對(duì)土壤的吸附程度不同，進(jìn)而造成蛋白殘留量的不同[15-16]。

隨生育期的推進(jìn)，4個(gè)品種轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉及其對(duì)照常規(guī)棉根際土壤中硝態(tài)氮含量呈下降的趨勢(shì)，雖因品種不同下降的程度不同，但均為生長(zhǎng)后期顯著低于生長(zhǎng)前期，吐絮期的硝態(tài)氮含量最低，這說(shuō)明生育期是影響棉花根際土壤硝態(tài)氮含量的主要因素[17]。此外，魯棉研36號(hào)、鑫秋4號(hào)硝態(tài)氮的含量顯著低于同期對(duì)照常規(guī)棉。這與趙云麗等[18]的研究結(jié)果較為相似。可能是因?yàn)橥庠椿虻膶?dǎo)入促進(jìn)根系更多地吸收土壤中的硝態(tài)氮[19]，使其在生長(zhǎng)前期對(duì)硝態(tài)氮的吸收和利用率優(yōu)于親本。

轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉及其對(duì)照常規(guī)棉根際土壤銨態(tài)氮的含量隨生育期的推進(jìn)呈下降趨勢(shì)。這表明，隨生育期的推進(jìn)，棉花對(duì)銨態(tài)氮的需求量不斷增加[20]。

因棉花品種不同，根際土壤銨態(tài)氮含量存在一定差異，4個(gè)品種轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉均表現(xiàn)出與對(duì)照常規(guī)棉的顯著性差異，這與部分已有研究結(jié)果較為相似[21]，根際土壤銨態(tài)氮含量可能通過(guò)土壤微生物的氨化強(qiáng)度或根系分泌物化學(xué)成分變化這兩個(gè)途徑發(fā)生改變。但也與許多研究結(jié)果存在差異，娜日蘇等[22]研究發(fā)現(xiàn)，播種后的60、90 d，供試2種棉花銨態(tài)氮含量無(wú)顯著差異。本試驗(yàn)與其他研究[23]結(jié)論不同可能是因?yàn)椴煌臍夂蚝屯寥罓顩r對(duì)根系分泌的Bt外源基因及其表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)生了影響，從而影響了這兩個(gè)途徑，使根際土壤銨態(tài)氮的含量發(fā)生了變化。

在棉花的整個(gè)生長(zhǎng)期，4個(gè)品種轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉及其對(duì)照常規(guī)棉根際土壤速效磷含量均呈上升的趨勢(shì)，這與烏蘭圖雅等[21]的研究結(jié)果較為一致。試驗(yàn)結(jié)果也得出，魯棉研28號(hào)、魯棉研36號(hào)根際土壤速效磷含量均顯著高于對(duì)照常規(guī)棉，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉可促進(jìn)磷素向速效態(tài)轉(zhuǎn)換[24]，但不同品種轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)轉(zhuǎn)換的促進(jìn)程度不同。但也有研究得出了不同的結(jié)論，Yang等[25]通過(guò)盆栽試驗(yàn)得出，轉(zhuǎn)基因棉花的種植可顯著降低花鈴期根際土壤中速效磷的含量。這與本試驗(yàn)結(jié)果存在差異，造成差異的原因可能是不同地區(qū)、不同年份土壤狀況和氣候狀況等不同，使種植轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響不同[21]。

綜上所述，生育期和轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的種植是影響棉花根際Bt蛋白殘留量、速效養(yǎng)分含量的主要因素，棉花品種也會(huì)對(duì)其產(chǎn)生一定的影響。就目前已有研究結(jié)果來(lái)看，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉種植對(duì)土壤生態(tài)環(huán)境影響存在不同程度的差異，這可能是棉田生態(tài)條件、材料選取、施肥管理等各類因素造成的。因此，對(duì)于轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉對(duì)根際土壤Bt蛋白殘留和速效養(yǎng)分含量影響的研究仍需進(jìn)行長(zhǎng)期的跟蹤試驗(yàn)，以期得到更為明確的結(jié)論。