一份特有紅花甜蕎活性物質的抗氧化特性研究

侯澤豪，孫坤坤，魏淑東，王書平，張迎新，尹軍良，劉志雄，方正武

(1. 長江大學 農學院/主要糧食作物產業化湖北省協同創新中心，湖北荊州 434025；2. 長江大學 生命科學學院，湖北荊州 434025；3 長江大學 園藝園林學院，湖北荊州 434025)

蕎麥，屬蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬，是一種重要的雜糧作物，分為甜蕎(FagopyrumesculentumMoench)和苦蕎(FagopyrumtaraicumGaerth)2個栽培品種，甜蕎為異花授粉作物，結實率較低，在亞洲、歐洲和美洲均有大量種植[1]，而苦蕎為自花授粉作物，主要栽培于中國，在多數西方國家被認為是野生植物[2]。蕎麥中富含多種藥用和營養保健成分，如膳食纖維、維生素、礦物質和多酚類物質等多種生物活性物質，具有降血壓、抗氧化和降低毛細管脆性等多種藥理作用，是重要的藥食兩用作物[3]。研究表明多酚類物質是食物具有抗氧化能力和抑制慢性疾病的主要原因之一[4]，而目前常使用化學抗氧化性的方法(如DPPH法、FRAP法、ORAC法和ABTS法)研究多酚類物質的抗氧化能力[4-6]。如Min等[7]利用DPPH法和ORAC法來評價具有不同麩皮顏色的大米的抗氧化能力，研究結果表明多酚物質的含量與抗氧化能力具有高度正相關。蕎麥因具有豐富的多酚類物質，因此，在食品工業上，蕎麥的籽粒、葉片和花可制成蕎麥茶或保健產品等，并起到降低血液中的膽固醇和葡萄糖水平的作用[8]。

作物植株顏色是一種重要的經濟性狀，鮮艷的顏色不僅能改善產品的色澤，而且能激發消費者的購買欲和食欲。花青素作為植物呈色中的一類重要色素，可使植物呈現粉紅色到藍紫色[9-10]，同時也是目前發現的最有效的天然水溶性自由基清除劑[11]。由于花青素的抗氧化能力及其在預防人類慢性疾病、控制肥胖和減輕糖尿病中的重要作用，因此，色彩鮮艷的天然食物受到國內外消費者的廣泛推崇[12-13]。

Suzuki等[14]通過反相液相色譜-電噴霧電離-串聯質譜技術對紅花蕎麥品種‘Gan-Chao’花瓣中的花青素質量分數和種類進行分析，結果表明紅花蕎麥花瓣中花青素種類以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷為主，而白花蕎麥花瓣中并未檢測到花青素的存在；Kim等[15]的研究發現‘Gan-Chao’花瓣中的花青素質量分數最高可達0.19 mg/g，但其葉片中僅含有微量的花青素。長江大學小麥與蕎麥種質創新課題組(以下稱本課題組)在前期的研究中，從中國貴州畢節地區收集到一份甜蕎農家品種(命名為‘HHTQ’)[16]，其子葉、葉片、葉柄和花序在田間生長發育時均表現為深紅色(圖1-A)，是一份特有的農家紅花蕎麥品種。

為了明確‘HHTQ’中活性物質的分布和抗氧化特性，本試驗采用高效液相色譜法對該材料的子葉、葉片、葉柄及花序的花青素質量分數進行測定，同時利用分光光度法測定其總酚和總黃酮質量分數，并分析FRAP抗氧化能力，DPPH·清除能力和ABTS+·清除能力，為進一步開發利用‘HHTQ’蕎麥資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試紅花甜蕎品種是本課題組于2009年從貴州畢節地區(105°36′E，26°21′N)征集所得，經 8 a選育，現命名為‘HHTQ’，并于長江大學農學院實驗基地(112°15′E，30°36′N)進行繁育。于2018年9月播種，待種子發芽出土，子葉完成展開后，對生長健壯且無病蟲害的植株進行子葉取樣；待植株生長50 d左右至盛花期，對葉柄、葉片和花序進行取樣，各樣品利用真空冷凍干燥機冷凍干燥后研磨成凍干粉，-20 ℃保存，備用。

1.2 儀器與試劑

UV-8000型紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)；Agilent1260高效液相色譜儀—Agilent 1260 series VWD 檢測器(美國Agilent 公司)；EYELA N-1200B 旋轉蒸發儀(東京理化器械株式會社)；真空冷凍干燥機(上海博醫康實驗儀器有限公司)；5810R 高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。

奎諾二甲基丙烯酸酯(Trolox)、沒食子酸(Gallic acid)、蘆丁(Rutin)、Folin酚試劑均購自美國Sigma公司；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷購自北京索萊寶科技有限公司；色譜純甲醇、甲酸均購自上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑為國產分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 花青素的提取及高效液相色譜分析 花青素的提取參考Chu等[17]的方法略加改動，準確稱取100 mg凍干樣品，置于15 mL 離心管中，加入5 mL含φ=1% HCl的甲醇提取液，于4 ℃下避光震蕩24 h。樣品經4 ℃，4 500 g離心10 min后，取500 μL上清液于新的1.5 mL離心管中，加入500 μL去離子和300 μL氯仿，充分混勻去除葉綠素，4 ℃ 13 500 g離心15 min，轉移上清液于新的1.5 mL離心管中，經0.22 μm濾膜(索來寶，北京)過濾后，-20 ℃保存，備用，每個樣品做3個生物學重復。

采用Agilent1260高效液相色譜儀對花青素提取液進行定量分析。色譜條件為：色譜柱Inertsil ODS-3(250 mm × 4.6 mm，5 μm)C18色譜柱(島津，日本)，進樣量20 μL，流速1 mL/min，檢測波長520 nm，柱溫25 ℃，流動相甲醇(A)-5%乙酸水溶液(B)，梯度洗脫0～2 min，10% A；2～6 min，10%～20% A；6～10 min，20%～30% A；10～15 min，30%～35% A；15～20 min，35%～50% A；20～24 min，50%～90% A；24～29 min，90%～10% A；29～30 min，10% A。以標準品矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(y= 21.513x-2.143 1，R2=0.998 8，測定范圍：5～50 μg/mL)和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷(y= 34.401x- 29.958，R2=0.998 3，測定范圍：5～75 μg/mL)建立標準曲線進行定量測定，其中y為峰面積，x為標準品質量濃度(μg/mL)，最終結果以每1 g樣品干質量中所含花青素(mg/g)表示。

1.3.2 蕎麥各組織游離酚物質的提取 參照Min等[7]的方法并稍有改進，準確稱取100 mg樣品凍干粉，置于10 mL離心管中，加入8 mL正己烷，上下顛倒混勻后靜置10 min，4 ℃，4 500 g離心10 min，棄上清，重復3次。向沉淀中加入8 mL含φ=1% HCl的甲醇提取液，每10 min上下顛倒1次，30 min后4 ℃ 4 500 g離心10 min，收集上清液，重復3次，合并上清液，37 ℃旋轉蒸發濃縮，用含φ=1% HCl的甲醇提取液復溶并定容至15 mL，每個樣品做3個生物學重復。

1.3.3 總酚和總黃酮質量分數的測定 采用Folin酚法[18]測定樣品中的總酚質量分數，總酚質量分數以干基每1 g樣品干質量中所含沒食子酸量(mg/g)表示；采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法[19]測定總黃酮質量分數，總黃酮質量分數以干基每1 g樣品中所含蘆丁量(mg/g)表示。

1.3.4 FRAP抗氧化能力、DPPH·和 ABTS+·清除能力測定 參考Benzie 和 Strain的方法[20]測定游離酚提取液的FRAP抗氧化能力，以奎諾二甲基丙烯酸酯(Trolox)作為標準品繪制標準曲線，得回歸方程y=0.005 3x-0.080 7 (R2=0.998 3)，其中y為吸光度，x為Trolox質量濃度(μg/mL)。結果以干基每1 g樣品中的質量分數(mg/g)表示。

參考Chen和Ho的方法[21]測定游離酚提取液的DPPH·清除能力，以Trolox當量為標準品繪制標準曲線，得回歸方程y= -0.002 7x+ 0.512 9(R2=0.995 1)，其中y為吸光度，x為Trolox質量濃度(μg/mL)。結果以干基每1 g樣品中的質量分數(mg/g)表示。

參考Re等[22]的方法測定游離酚提取液的ABTS+·清除能力，以Trolox當量為標準品繪制標準曲線，得回歸方程y=-0.00 3x+ 0.800 8(R2= 0.997 4)，其中y為吸光度，x為Trolox質量濃度(μg/mL)。結果以干基每1 g樣品中的質量分數(mg/g)表示。

1.4 數理統計

利用Excel 2013和SPSS 19.0 軟件進行數據統計和分析，數據以平均值 ± 標準差(Means ± SD)表示，采用單因素方差分析，不同組織間比較采用Duncan’s法，顯著水平為0.05，利用Origin 2017進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 紅花甜蕎‘HHTQ’的表型性狀

由圖1-A可以看出，‘HHTQ’蕎麥材料表現出鮮艷的色彩，其葉片邊緣、葉脈以及葉柄呈紫紅色。同時在整個花期，其花序均呈現出鮮艷的紅色，可能富含花青素，具有一定的觀賞價值和潛在應用價值。

2.2 紅花甜蕎‘HHTQ’不同部位的花青素質量分數

利用HPLC對紅花甜蕎‘HHTQ’不同部位花青素提取液進行定量測定(圖1-B和表1)，發現4個部位的花青素積累差異較大。花序和葉柄中積累的花青素質量分數最高，顯著高于葉片和子葉(P<0.05)。花序和葉柄積累的花青素總質量分數無顯著差異，分別為3.43 mg/g和3.28 mg/g，但具有不同的花青素單體積累模式，花序中以積累矢車菊素-3-O-蕓香糖苷為主，質量分數達2.90 mg/g，占總質量分數的84.55%；而葉柄中則積累大量的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷，其質量分數達 3.02 mg/g，占花青素總質量分數的 92.07%。子葉的花青素積累模式與葉柄相似，以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷為主(0.96 mg/g，占總質量分數的 72.73%)，而葉片則表現為等量積累。

A.紅花甜蕎‘HHTQ’不同部位的表型性狀 Phenotypes of the four plant parts of the red-flowers buckwheat variety of ‘HHTQ’； B.花序、葉柄、葉片和子葉花青素提取液的高效液相色譜分析 HPLC profiles of anthocyanins extracted from the cotyledons, blades, petioles and inflorescences of the red-flowers buckwheat variety of‘HHTQ’

圖1 紅花甜蕎‘HHTQ’不同部位的花青素成分分析Fig.1 Anthocyanin composition analysis of different parts of red-flowers buckwheat variety ‘HHTQ’

注：同列中不同小寫字母表示組織間差異達顯著水平(P<0.05)，下同。

Note:In the same columns,the different lowcase letters means significant difference (P<0.05)，the same below.

2.3 紅花甜蕎‘HHTQ’不同部位總酚和總黃酮質量分數

由表2可知，紅花甜蕎‘HHTQ’總酚和總黃酮在4個不同部位中的積累量存在顯著差異(P<0.05)，且總酚和總黃酮的積累模式在4個部位具有一致性，以花序中最高(總酚質量分數為225.47 mg/g，總黃酮質量分數為128.96 mg/g)，葉柄中最低(總酚質量分數為26.59 mg/g，總黃酮質量分數為16.28 mg/g)。4個部位的總酚和總黃酮質量分數大小順序均為：花序>葉片>子葉>葉柄。

2.4 紅花甜蕎‘HHTQ’不同部位抗氧化能力

‘HHTQ’蕎麥4個不同部位的抗氧化能力如圖2所示。4個不同部位的DPPH·清除能力的變幅為47.52～174.51 mg/g。各部位的 DPPH·清除能力差異較大，以花序的清除能力最強，為174.51 mg/g；其清除能力大小順序為：花序>葉片>子葉>葉柄。FRAP抗氧化能力與DPPH·清除能力趨勢一致，以花序最高，為 152.55 mg/g；葉片次之，為37.56 mg/g；以葉柄最低，為17.16 mg/g。在ABTS+·清除能力方面，花序的抗氧化能力顯著高于其他部位(P< 0.05)，為112.31 mg/g；葉柄，葉片和子葉的ABTS+·清除能力無差異，ABTS+·清除能力變幅為 8.63～12.05 mg/g。

表2 紅花甜蕎‘HHTQ’不同部位總酚和總黃酮質量分數Table 2 Total phenols and total flavonoids in different parts of red-flower buckwheat variety of ‘HHTQ’ mg/g

不同字母表示差異顯著(P<0.05) Different letters mean significantly differences(P<0.05).

圖2 紅花甜蕎‘HHTQ’不同部位抗氧化能力
Fig.2 Antioxidant abilities of different parts of red-flower buckwheat variety of ‘HHTQ’

2.5 紅花甜蕎‘HHTQ’多酚類物質質量分數與抗氧化能力的相關性分析

總酚、總黃酮和總花青素與抗氧化能力的相關系數如表3所示。總酚和總黃酮質量分數與DPPH·清除能力、FRAP抗氧化能力以及ABTS+·清除能力的相關性較大，相關系數在0.980以上。與總酚與總黃酮質量分數相比，總花青素與3個抗氧化能力指標的相關系數較低，分別為0.594(DPPH·清除能力)、0.530(FRAP抗氧化能力)和0.601(ABTS+·清除能力)。這些結果表明花青素作為一類酚類化合物，在植物抗氧化能力上發揮了一定的作用。

表3 總酚、總黃酮和總花青素質量分數與抗氧化能力的相關系數Table 3 Correlation coefficients of total phenols, total flavonoids and total anthocyanins with the antioxidant capacities

3 討 論

3.1 蕎麥中花青素的積累

前人的研究發現紅花甜蕎‘Gan-Chao’花瓣中的花青素質量分數隨發育時期的變化而增加[14-15]，最高可達0.19 mg/g，但其葉片中僅含有微量的花青素[15]。本研究利用HPLC對紅花甜蕎‘HHTQ’的花青素質量分數進行測定，發現該甜蕎品種在子葉、葉片、葉柄和花序中均積累了大量的花青素，花序中積累的花青素總質量分數達到3.43 mg/g，子葉和葉片中的花青素總質量分數分別達到1.32 mg/g和1.44 mg/g，顯著高于‘Gan-Chao’。Kim等[15]利用熒光定量PCR技術分析發現與花青素合成相關的結構基因(如FePAL、FeCHS、FeDFR和FeANS等)在紅花蕎麥‘Gan-Chao’中表現出較高的表達量。周天山等[23]的研究發現紫芽茶樹中富含花青素，與綠芽茶樹相比，紫色芽葉片的花青素相關基因(如CsDFR、CsANS和 CsF3′H等)呈上調趨勢，而本課題在前期對紅花品種‘HHTQ’的轉錄組測序分析中同樣發現，‘HHTQ’的子葉和花序中與花青素合成相關的結構基因(如FeCHS、 FeF3′H和FeDFR)表現出較高的表達量[16]，但其內在分子機理仍待研究，進一步探索花青素的積累機制對于培育和應用富含花青素的蕎麥品種具有潛在價值。

3.2 蕎麥中的總酚和總黃酮質量分數

多酚是廣泛存在于植物組織中的一類具有生物活性的次級代謝產物[24]，黃酮類物質(如蘆丁、表兒茶素等)是蕎麥多酚類物質的重要組成成分[25]，因具有抗癌和抗氧化等多種作用而被廣泛應用于抗癌以及預防冠心病等心腦疾病的藥物當中[26]。由于蕎麥中富含多種維生素，必需氨基酸和多酚等功能活性物質，因此蕎麥作為一種營養保健的粗糧而深受喜愛[27]。本次研究對蕎麥不同部位的總酚質量分數進行測定，發現4個不同部位的總酚質量分數存在顯著差異(P<0.05)，以花序中的總酚質量分數最高，為225.47 mg/g，且其總黃酮積累模式與總酚一致，以花序最高，為128.96 mg/g。總酚和總黃酮質量分數高低順序均為：花序>葉片>子葉>葉柄。這一研究結果與Zielinska等[28]的研究發現蕎麥不同部位的總黃酮化合物積累量差異較大(花朵>葉片>莖)的結果相似。

3.3 蕎麥多酚類物質的抗氧化能力

前人的研究結果表明，蕎麥籽粒的抗氧化能力與總黃酮/蘆丁的含量成正相關，黃酮類物質的積累量越高，其抗氧化能力最強[28-29]。本研究發現蕎麥4個不同部位的抗氧化能力存在顯著差異，以花序最高，葉柄最低，且總酚和總黃酮質量分數與DPPH·清除能力、FRAP抗氧化能力以及ABTS+·清除能力的相關系數均在0.98以上，但花青素質量分數與抗氧化能力的相關系數僅為0.530～0.601。前人在紫薯的研究中發現，不能單獨利用花青素質量分數解釋抗氧化能力的強弱，而是由多種生物活性物質(如酚類化合物、維生素C和胡蘿卜素等)綜合決定[30-32]，在本次研究中，發現葉柄中雖積累大量的花青素，但其總酚和總黃酮的質量分數最低，從而導致其抗氧化能力顯著低于含有較高總酚和總黃酮質量分數的葉片和子葉。因此，全面準確地分析蕎麥不同部位抗氧化能力對指導其開發利用具有重要價值。

4 結 論

該紅花甜蕎品種‘HHTQ’具有鮮紅的表型性狀，且其花序、葉柄、葉片和子葉中花青素、總酚、總黃酮質量分數及其體外抗氧化能力差異較大，該品種的花青素類型以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷2種為主，且花青素單體的積累具有組織特異性，花序中矢車菊素-3-O-蕓香糖苷質量分數、總酚和總黃酮質量分數顯著高于其他部位，同時抗氧化能力最強。葉片和子葉中均積累了一定量的多酚類物質，具有較強的抗氧化能力。鑒于該品種具有豐富的酚類物質和較強的抗氧化活性，可以將其作為蕎麥茶新產品和天然抗氧化劑資源進行開發利用。