過表達 GhMYB4基因對棉花莖稈木質素合成的影響

夏成林，于月華，左 林，陳全家，倪志勇

(新疆農業大學 農學院,烏魯木齊 830052)

MYB轉錄因子是植物中功能最多樣化的家族之一，已被證實在多種植物中參與調控不同的代謝途徑[1]。MYB轉錄因子具有1～4個由 50～53個氨基酸殘基構成的不完全重復的高度保守的DNA結構域，即MYB結構域[2]，根據其結構域位置和數目的不同，可將其分為4類(R1/2-MYB 或R3-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB)[3]。自從在玉米中克隆首個MYB轉錄因子基因 C1[4]后，在多種生物中也相繼發現含有R2R3-MYB的同源基因，研究發現MYB 轉錄因子參與調節多種次生代謝途徑，如苯丙烷類代謝途徑、細胞壁組分合成和硫代葡萄糖苷的生物合成等，進而對植物次生壁的形成發揮調控作用[5]。

木質素(Lignin)是一種苯環結構的天然高分子物質，是構成植物細胞壁骨架的重要組成部分[6]。在植物維管組織的機械強度、抵抗病菌侵害和運輸水分等方面發揮著重要作用[7]。近年來的研究表明，MYB轉錄因子與多種順式作用元件結合，調控下游基因的表達。MYB轉錄因子與木質素代謝相關基因啟動子序列中的一些順式作用元件結合，如AC-Ⅰ、AC-Ⅱ、AC-Ⅲ等順式作用元件，進而對木質素的合成產生促進或抑制作用[8]。木質素含量降低會造成作物株系易倒伏，易被病菌侵染等不良狀況的發生[9]。為了克服這一現象，一些經濟作物的改良需要適當增加木質素在莖稈中的合成積累，適當提高單位面積下細胞的數目，降低細胞排列分布的間隙，使改良的木質部導管壁韌性加強，從而可以在極大程度上降低病菌的感染入侵，對減少水分流失也有一定抑制作用[10]。

陸地棉(Gossypiumhirsutum)是世界上重要的經濟作物之一。棉花的抗倒伏性狀依賴于莖稈組織中木質素的機械支撐作用。因此，研究調控棉花莖稈木質素代謝的MYB轉錄因子的功能具有重要的意義。本研究旨在分析過表達 GhMYB4基因對陸地棉莖稈中木質素合成的影響。為深入研究 GhMYB4基因在陸地棉中的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料 對照受體棉花株系為‘cqj-5’，轉基因過表達 GhMYB4棉花株系為T4代植株，編號為‘lrp1’～‘lrp29’。試驗材料栽種于新疆農業大學棉花光照培養室培育。

1.1.2 試劑 甲醇、巰基乙酸、濃鹽酸、氫氧化鈉、木質素標準品、間苯三酚、超純水和雙蒸水。

1.2 方 法

1.2.1 棉花莖稈木質素化學組織染色 對35～55 d棉花莖稈材料進行化學組織染色。分別取對照受體和轉基因型株系距離下胚軸0～1 cm、 2～7 cm、10～12 cm部位徒手制作臨時切片。參考Wiesner法[11]在切片表面滴加w=15%間苯三酚和φ=10%鹽酸溶液，漂洗后于光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.2 棉花莖稈木質素總量測定 樣品取自 45 d棉花莖稈距離下胚軸2～7 cm處的對照受體株系和轉基因株系莖稈，做3次生物學重復試驗。參考Klason法[12]，獲得木質素-巰基乙酸(LTGA)沉淀物。用2 mL的0.5 mol/L氫氧化鈉溶液溶解棕色沉淀。在紫外分光光度計下的280 nm處測定木質素溶液的吸光度。

1.2.3 棉花木質素標準品標準曲線測定 稱取100 mg木質素標準品于100 mL的0.5 mol/L氫氧化鈉溶液溶中，終質量濃度為1 mg/mL。在25 mL容量瓶中將木質素的終質量濃度再稀釋成不同的6份，用紫外分光光度計在280 nm處測定溶液的吸光值。

表1 棉花木質素標準曲線質量濃度的測定Table 1 Determination of cotton lignin standard curve

1.2.4 棉花木質素質量分數測定 通過標準曲線的回歸方程計算出棉花莖稈中木質素的質量濃度 ，再利用下面公式計算其質量分數。

木質素質量分數=C(μg/mL)×2(mL)× 0.001/0.03(g)

2 結果與分析

2.1 棉花莖稈木質素的化學組織染色

用Wiesner法對棉花莖稈進行染色，根據染色程度的深淺和范圍可以初步反映出木質素的積累情況，以及所在的組織位置和分布情況。以下試驗株系均是以轉基因‘lrp17’株系為例與對照受體‘cqj-5’株系進行的結果比對分析。

2.1.1 初生木質部木質素染色范圍距離分析 在電子顯微鏡10×物鏡下觀察木質素組織染色區域發現(圖1)，在距離下胚軸0～1 cm、2～ 7 cm、10～12 cm處進行對比，依據細胞排列的方向進行直線測量，發現大部分的‘lrp17’轉基因株系相比對照受體‘cqj-5’株系在初生木質部區域的染色范圍距離更長。在初生木質部染色范圍距離的定量分析發現(圖2)，在距離下胚軸0～1 cm和2～7 cm中，轉基因株系和對照受體株系在染色的范圍距離上具有顯著性的增加。

2.1.2 初生木質部木質素染色細胞層數分析 在電子顯微鏡40×物鏡下觀察初生木質部染色區域發現(圖3)，大部分轉基因‘lrp17’株系初生木質部的細胞排列層數相比對照受體株系‘cqj-5’有一定增多。通過對細胞層數的定量分析發現(圖4)，在距離下胚軸2～7 cm處，轉基因‘lrp17’株系相比對照受體‘cqj-5’株系具有顯著性的增加。

2.1.3 初生韌皮部木質素染色深淺程度分析 在電子顯微鏡40×物鏡下觀察初生韌皮部染色區域發現(圖5)，在距離下胚軸0～1 cm、2～ 7 cm、10～12 cm處進行對比，‘lrp17’轉基因株系相比對照受體‘cqj-5’株系的染色程度大部分都有顯著性的加深。

2.2 棉花莖稈木質素總量測定分析

通過木質素標準品參與得到標準曲線測定的結果，用Excel計算得回歸方程：y=312.941x- 9.565(R2=0.999 175，y為待測液質量濃度，x為待測液吸光度值)。將對照受體株系‘cqj-5’和‘lrp1’～‘lrp29’系列的每一個棉花株系的莖稈進行木質素總量測定，數值帶入回歸方程中。結果表明(圖6)，轉基因株系中的‘lrp13’‘lrp15’‘lrp16’‘lrp18’和‘lrp29’株系相比對照受體‘cqj-5’株系的木質素質量分數沒有出現顯著性的增減差異，‘lrp19’株系的木質素質量分數出現顯著性的減少現象，其他23個株系均與對照受體株系‘cqj-5’的木質素質量分數有顯著性增加，其中‘lrp17’株系木質素的表達量最高。

a.初生木質部 Primary xylem;b.初生韌皮部 Primary phloem；刻度尺為10 μm The scale is 10 μm;下圖3和圖5同此 Fig.3 and Fig.5 are the same

圖1 電子顯微鏡10×物鏡下的35～55 d轉基因‘lrp17’株系與受體株系‘cqj-5’(CK)棉花材料莖稈的橫切木質素組織化學染色分析
Fig.1 Cross-cut lignin histochemical staining analysis of cotton stalks of 35-55 d transgenic ‘lrp17’ strain and recipient strain ‘cqj-5’(CK) under electron microscope 10×objective

數值是3次生物學重復的“平均值±標準差”，星號表示明顯不同于對照受體cqj-5(P<0.05)，下同 Values are “mean ± standard” deviation of three biological replicates,and asterisks indicate significantly different from control receptor cqj-5(P<0.05).The same bellow

圖2 在電子顯微鏡40×物鏡下的35～55 d轉基因‘lrp17’株系與受體株系‘cqj-5’(CK)棉花材料莖稈的橫切木質素組織化學染色距離分析
Fig.2 The cross-cut lignin histochemical staining distance analysis of the 35-55 d transgenic ‘lrp17’ strain and the recipient strain ‘cqj-5’(CK) cotton material stem under the electron microscope 40×objective lens

3 討論與結論

之前的研究表明，在大多數植物生長發育進程中MYB轉錄因子對次生壁的表達調控存在促進或抑制作用[13-14]。本研究通過對棉花莖稈木質素染色分析發現，過表達 GhMYB4株系相比對照受體株系初生木質部的染色范圍擴大、細胞層數增多，且初生韌皮部染色加深。大部分過表達 GhMYB4基因株系相比對照受體株系莖稈木質素質量分數增加，因此推測 GhMYB4轉錄因子可能正調控棉花莖稈的木質素代謝。

圖3 電子顯微鏡40×物鏡下的35～55 d轉基因‘lrp17’株系與受體株系‘cqj-5’(CK)棉花材料莖稈的橫切木質素組織化學染色分析Fig.3 Cross-cut lignin histochemical staining analysis of cotton stalks of 35-55 d transgenic ‘lrp17’ strain and recipient strain ‘cqj-5’(CK) under electron microscope 40×objective

圖4 在35～55 d轉基因‘lrp17’株系與受體株系‘cqj-5’(CK)棉花材料莖稈的橫切木質素組織化學染色分析下的細胞層數測量Fig.4 The number of cell layers under the cross-cut lignin histochemical staining analysis of the 35-55 d transgenic ‘lrp17’ strain and the recipient strain ‘cqj-5’(CK) cotton material stem

在許多植物中陸續發現多種MYB轉錄因子對次生壁中的木質素合成起到一定促進或抑制作用。如在擬南芥過表達菊花 CmMYB1基因能夠在一定程度上抑制次生壁中木質素的合成積累[15]。擬南芥 AtMYB58和 AtMYB63[16]，小麥 TaMYB4[17]，以及玉米 ZmMYB31和 ZmMYB46[18-19]等基因都在次生壁發育過程中調控木質素的合成。火炬松 PtMYB4[20]與 Ptmyb1[21]和桉樹 EgMYB2[22]轉錄因子通過與啟動子區域中的AC順式作用元件結合，從而對木質素的生物合成起到正調控作用；水稻 OsMYB46基因可以促進表皮細胞木質素和木聚糖纖維素的合成[23]；擬南芥 AtMYB46基因受NST3的調控，通過同時對 AtMYB85和 KNAT7基因的多級轉錄調控，進而對次生壁的木質素含量產生抑制或促進作用[24]。本研究發現 GhMYB4基因在陸地棉莖稈中參與次生壁木質素的合成，本研究為進一步探究 GhMYB4基因的生物學功能奠定理論基礎。

圖5 電子顯微鏡40×物鏡下的35～55 d轉基因‘lrp17’株系與受體株系‘cqj-5’(CK)棉花材料莖稈的橫切木質素組織化學染色分析Fig.5 Cross-cut lignin histochemical staining analysis of the 35-55 d transgenic ‘lrp17’ strain and the recipient strain ‘cqj-5’(CK) cotton material stem under electron microscope 40×objective

星號表示明顯不同于對照受體‘cqj-5’(P<0.01) The asterisk indicates significantly different from the control receptor ‘cqj-5’ (P<0.01)

圖6 受體‘cqj-5’(CK)和轉基因‘lrp1’～‘lrp29’棉花株系莖稈中木質素質量分數
Fig.6 Mass fraction of lignin in the stems of the receptor ‘cqj-5’(CK) and the transgenic ‘lrp1’-‘lrp29’ cotton