水分脅迫對赤霞珠葡萄果實花色苷生物合成的影響

呂丹桂，謝 岳，徐偉榮，王振平

(寧夏大學 農學院，銀川 750021)

花色苷是一種水溶性植物色素，屬類黃酮的一個亞類，在葡萄果實表皮細胞的細胞質中合成，然后運輸到液泡中貯藏[1]。花色苷的質量濃度及組分不僅影響葡萄漿果的成熟度和品質，而且也影響葡萄酒的色澤、風味和營養價值[2-3]。此外，花色苷還具有抗氧化，防治癌癥，減輕炎癥，抗疲勞等功能[4-5]，廣泛用于醫藥及保健食品中。目前，對葡萄果實花色苷生物合成和果實著色機理的研究已較為清晰，花色苷生物合成分為2個階段：第1個階段是苯丙烷類代謝途徑，第2個階段是類黃酮途徑[6](圖1)，花色苷生物合成由結構基因和調節基因控制[7]，但也受溫度、光照，水分及生長調節劑等環境因素的影響[8-10]。

土壤水分質量濃度通過影響葡萄果實類黃酮物質的積累，從而影響葡萄與葡萄酒品質[11]。調虧灌溉(regulated deficit irrigation，RDI)能顯著增加葡萄果實花青素和酚類物質濃度，提高果實品質[12]。但目前，對于葡萄水分脅迫的研究主要集中在抗旱指標、光合特性、產量和果實品質等方面[13-14]，而對果實花色苷影響的研究較少。本研究以3 a生釀酒葡萄‘赤霞珠’(VitisviniferaL.Cabernet Sauvignon)為試驗材料，在葡萄轉色前到成熟期，對其進行不同水分脅迫處理，通過研究不同水分脅迫對葡萄果實總花色苷質量分數以及花色苷合成相關基因表達的影響，分析花色苷合成過程中花色苷與相關基因表達量的關系，闡述水分脅迫對葡萄花色苷的調控機制，以期為釀酒葡萄水分管理及品質提升提供理論依據和技術 指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

試驗于2016年4月至9月在寧夏玉泉營農場(38.28°N，106.24°E)國家葡萄產業技術體系水分生理與節水栽培崗位試驗基地具有調控溫濕度的玻璃溫室中進行，以3 a生‘赤霞珠’葡萄(VitisviniferalL.Cabernet Sauvignon)為材料，采用無土限根栽培模式，葡萄種植在長4.0 m，寬0.8 m，高0.5 m的種植槽中，每槽8株，株距50 cm，杯狀整形，每株留5～6個結果梢。槽內覆2層華盾PE耐老化(I)型棚膜，填充材料為蛭石、珍珠巖及草炭灰(1∶1 ∶1，V∶V∶V)。槽內采用時控儀控制器進行灌溉，每個槽有2列滴管，間距20 cm，滴管直徑2 cm，滴頭間距50 cm，流量3.1 L/min，每天8:00統一灌溉，灌溉液為改良霍格蘭營養液。

該試驗材料2016-05-13為盛花期(full bloom，E-L23)[15]，2016-07-12為轉色期(véraison，E-L35)，于2016-07-05果實轉色前1周(花后53 d)開始試驗處理，通過控制灌溉時間來控制灌水量，以黎明前葉片基礎水勢(Ψb)值大小反應脅迫程度，根據Bahar等[16]研究，設置4個處理(表1)，每個處理占用3個木槽，即代表3次生物學重復。于2016-07-12(60 d)開始采樣，每10 d采樣1次，直到2017-09-02(110 d)果實成熟期，在各種植槽的每棵植株上，隨機剪取果實，液氮速凍后，-80 ℃超低溫冰箱保存，備用。

PAL.苯丙氨酸裂解酶 Phenylalanin ammo-nialyase；C4H.肉桂酸-4-羥化酶 Cinnamic acid -4- hydroxylase；4CL.4-香豆酸-CoA連接酶 4-Coumarate-CoA ligase；CHS.查爾酮合成酶 Chalcone synthase；CHI.查爾酮異構酶 Chalcone isomerase；F3H.黃烷酮3-羥化酶 Flavanone 3-hydroxylase；F3′H.類黃酮3′-羥化酶 Flavanone 3′-hydroxylase；F3′5′H.類黃酮3′5′-羥化酶 Flavanone 3′5′-hydroxylase；DFR.黃烷酮醇4-還原酶 Dihydroflavonol 4-reductase；LDOX.無色花色素雙加氧酶 Leucoanthocyanidin dioxygenase；UFGT.類黃酮葡萄糖轉移酶 UDP glucose flavonoid glucosyl-transferase;OMT:O-甲基轉移酶 O-methyltran-sferase

圖1 花色苷生物合成途徑[6]
Fig.1 Anthocyanin biosynthesis pathway

1.2 測定項目與方法

1.2.1 葡萄果實品質指標及百粒質量測定 隨機取300粒果實稱量。可溶性固形物(TSS)質量分數用WYT-32型手持糖量折光儀測定。可滴定酸采用NaOH滴定法測定。單寧采用福林丹尼斯法[17]測定。總酚采用福林酚法[17]測定。

1.2.2 總花色苷質量分數的測定 采用pH示差法[18]測定總花色苷質量分數。

1.2.3 總RNA提取和qRT-PCR 使用北京愛普拜生物有限公司的PEXBIO植物果實總RNA抽提試劑盒提取RNA。使用Takara公司PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real time)試劑盒反轉錄合成cDNA。內參基因選取Actin和EF。在Genebank中查找得到PAL、 CHS1、 F3′H、 F3′5′H、DFR、UFGT和 MybA1的特異性序列，然后登錄http://www.idtdna.com/primerquest/Home/Index進行引物設計，引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成(表2)。qRT-PCR反應體系： 2×Ultra SYBR Mixture (CWBIO) 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，模板2 μL，引物1 μL(上游引物和下游引物各0.5 μL)。qRT-PCR反應程序： 95 ℃10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環， 72 ℃熔解擴增產物7 min。所有樣品都設置3個重復，用ddH2O代替cDNA作為NTC對照。采用2-ΔΔCt法對數據進行計算[19]。

表1 不同處理葉片基礎水勢及日灌水量Table 1 Basic water potential and daily irrigation of different treatments

表2 實時熒光定量PCR引物序列Table 2 Primer sequences for real-time quantitative PCR

1.3 數據處理

用Microsoft office excel 2013繪圖；采用Sigmaplot 12.5進行數據處理，用LSD法進行One Way ANOVO分析。

2 結果與分析

2.1 不同水分脅迫處理對采收期葡萄果實組分的影響

由表3可知，T3百粒質量顯著低于CK，且T1、T2和T3較CK分別降低1.5%、11.1%和25.9%，表明葡萄果實百粒質量隨水分脅迫程度的增加而降低，過度脅迫可抑制果實生長。T1和T2的可溶性固形物質量分數顯著高于CK，分別比CK高9.3%和5.7%；T3則低于CK，表明輕度和中度水分脅迫可提高果實TSS質量分數。T1和T2的可滴定酸(TA)質量濃度低于CK，表明輕度和中度水分脅迫會降低TA的質量濃度，而T3極顯著高于CK，說明重度水分脅迫提高了TA質量濃度。單寧和總酚的質量分數均為T1顯著高于CK，分別較CK增加了27.7%和 35.8%，而T2與CK差異不顯著，T3的單寧和總酚質量分數則低于CK，表明輕度水分脅迫有利于單寧和總酚的積累，而重度水分脅迫抑制了單寧和總酚的積累。

處 理Treatment百粒質量/gHundred grain mass可溶性固形物/%Total soluble solid可滴定酸/(g/L)Titratable acid 單寧/(mg/g)Tannins總酚/(mg/g)Total phenolsCK142.69±0.14 Aa20.53±0.42 ABb3.75±0.11 Bb1.48±0.03 Ab2.12±0.05 ABbT1140.49±0.16 Aab22.66±0.57 Aa3.56±0.13 Bb1.89±0.07 Aa2.88±0.07 AaT2126.84±0.33 Aab21.71±0.16 Aab3.19±0.09 Bc1.66±0.05 Aab1.97±0.12 ABbcT3105.79±0.37 Ab17.31±0.32 Bc4.50±0.04 Aa1.34±0.09 Ab1.78±0.05 Bc

注：同列不同小寫字母表示差異達到0.05顯著水平，不同大寫字母表示差異達到0.01顯著水平。

Note:Different lowercase letters in each column mean significant different at 0.05 level,different capitals mean significant different at 0.01 level.

2.2 水分脅迫對葡萄果實總花色苷質量分數的影響

葡萄果實總花色苷質量分數隨著葡萄果實的成熟呈上升趨勢(圖2)。不同水分脅迫處理對總花色苷質量分數的影響不同。從70 d至110 d，T1和T2總花色苷質量分數均高于CK，在110 d達到最大，且顯著高于CK，分別為0.241%和 0.288%，T3除在70 d和80 d高于CK外，而其余時間均低于CK，表明輕度和中度水分脅迫能增加果實總花色苷質量分數，短期的重度脅迫也可以增加總花色苷質量分數，但長期的重度脅迫則不利于其積累。

2.3 水分脅迫對葡萄果實花色苷生物合成相關基因表達量的影響

在葡萄果實轉色后，與花色苷生物合成相關基因的表達量均呈現逐漸上升后下降的趨勢(圖3)。不同程度水分脅迫處理對相關基因表達量的影響不同。T1、T2和T3處理PAL基因相對表達量從70 d至110 d均高于CK，表明水分脅迫處理導致PAL基因表達量的增加。T1和T2組 CHS1、DFR、 F3′H、 F3′5′H、UFGT和 MybA1基因相對表達量在70 d至110 d也基本上均高于CK，但T3組基本上在100 d至110 d低于CK，表明輕度和中度水分脅迫能使 CHS1、DFR、 F3′H、 F3′5′H、UFGT和 MybA1基因的表達量增加，而重度水分脅迫會降低果實成熟后期 CHS1、 F3′H、 F3′5′H和UFGT表達量而降低了總花色苷質量分數。

小寫字母表示顯著差異(P≤0.05)，未標注字母表示差異不顯著，下同

Lowercase letters mean significant differences (P≤ 0.05), unmarked letters mean no significant differences.The same below

圖2 水分脅迫下葡萄果實總花色苷質量分數
Fig.2 Total anthocyanin mass fraction of grape berries in water stress

2.4 葡萄果實總花色苷質量分數與花色苷生物合成相關基因相對表達量的相關性分析

在果實成熟過程中，花色苷合成與其相關基因的相對表達量具有一定的相關性(表4)，其中，PAL、 CHS1和 MybA1的相對表達量與總花色苷質量分數的相關系數較高。水分脅迫能提高一些基因與總花色苷質量分數的相關性。其中，T2處理下 CHS1的相對表達量與花色苷合成呈顯著正相關，相關系數為0.897，T3組PAL和 MybA1的相對表達量與花色苷合成呈顯著正相關，相關系數分別為0.900和0.904。

圖3 水分脅迫下葡萄果實花色苷合成途徑相關基因表達量Fig.3 Gene expression of anthocyanin biosynthesis pathway in grape berries in water stress

處理 TreatmentPAL CHS1DFRUFGT MybA1CK0.692-0.0420.3090.6430.818T10.7580.5530.4050.8120.648T20.853 0.897*0.8610.6350.811T3 0.900*-0.0380.355-0.297 0.904*

注：* 表示P≤0.05水平相關。

Note:* is related to the level ofP≤ 0.05.

3 討論與結論

本研究表明，不同程度水分脅迫對葡萄果實組分影響不同，輕度和中度脅迫均降低果實百粒質量和TA質量濃度，提高TSS、總酚、單寧和總花色苷質量分數，而重度脅迫反之。在果實轉色后，花色苷生物合成相關基因的表達量均呈先上升后下降的趨勢。不同程度水分脅迫處理對相關基因表達量的影響也不同。輕度和中度脅迫上調了PAL、 CHS1、DFR、 F3′H、 F3′5′H、UFGT和 MybA1基因的表達量，重度脅迫降低了果實成熟后期 CHS1、 F3′H、 F3′5′H和UFGT表達量。相關性分析表明，中度脅迫 CHS1表達量與總花色苷質量分數呈顯著正相關，重度脅迫PAL和 MybA1基因表達量與總花色苷質量分數呈顯著正相關。

國內外大量研究表明，在不同物候期進行水分脅迫能改善葡萄果實的品質[20]。在葡萄轉色期進行調虧灌溉會降低漿果的體積、質量以及酸度，且顯著提高了可溶性固形物質量分數和果實酚類物質濃度[21]。本研究中，輕度和中度脅迫降低了漿果百粒質量、可滴定酸質量濃度，提高了可溶性固形物、單寧和總酚質量分數，與前人研究結果相一致。李云飛等[22]發現重度干旱會降低紫葉矮櫻葉片可溶性糖和花青素質量濃度。本研究中重度脅迫降低了果實可溶性固形物、單寧和總酚質量分數，與其研究結果相似，這可能是由于重度脅迫抑制了植株的生長發育及代謝。Ollé等[23]發現無論在轉色前還是在轉色后對葡萄植株進行水分脅迫，都會增加果實花色苷的質量分數，但花色苷組分有所不同。本研究中，轉色前輕度和中度脅迫處理均增加了總花色苷積累量，這與前人研究結果一致。但是，重度脅迫卻降低了總花色苷質量分數，這可能是由于花色苷的積累與葡萄果實糖的積累有關[24]，而重度脅迫會降低葡萄果實糖的積累，導致花色苷質量分數降低。

周莉等[25]研究表明，從轉色期開始，葡萄果實花色苷生物合成轉錄水平上調，在果實完熟后，轉錄水平下調。本研究中，葡萄果實轉色至成熟，與花色苷生物合成相關基因的表達量均呈現先上升后下降的趨勢，與其研究結果一致。水分脅迫會改變花色苷生物合成過程相關基因的轉錄水平，并上調葡萄花色苷合成途徑 F3H、DFR、UFGT、 F3′H、 F3′5′H和GST基因的表達[26]。本研究中，輕度和中度脅迫使PAL、 CHS1、DFR、 F3′H、 F3′5′H、UFGT和 MybA1基因的表達上調，與前人研究結果一致。而重度脅迫降低了果實成熟后期 CHS1、 F3′H、 F3′5′H和UFGT表達量。因此，重度脅迫導致總花色苷質量分數降低，可能是由于UFGT是催化不穩定的花色素糖基化形成穩定的花色苷-3-葡萄糖苷的關鍵結構基因[27]，且重度脅迫顯著降低了果實糖質量濃度。花色苷生物合成中相關基因表達量與總花色苷質量分數的變化具有相關性[28-29]。本試驗表明，中度脅迫 CHS1表達量與總花色苷質量分數呈顯著正相關，重度脅迫PAL和 MybA1基因表達量與總花色苷質量分數也呈顯著正相關，這也驗證了前人的結果，并且水分脅迫提高一些基因表達量與花色苷總量的相關性。

水分脅迫通過控制葡萄植株的生長發育改善葡萄漿果的成熟度，調節葡萄花色苷生物合成過程中相關基因的表達從而提高了葡萄果實總花色苷質量分數，同時也提高了水分利用效率[30-31]。本研究表明，輕度和中度脅迫有利于葡萄漿果品質的改善，促進了葡萄果實花色苷的生物合成，與對照相比分別節約灌水38.2%和69.1%，建議在生產中減少灌水，以達到合理的水分脅迫之目的，為生產優質葡萄酒提供優質原料。