梭梭 HaNAC2的表達分析和抗逆功能鑒定

宗興風，劉栓栓，劉 豪，姚正培，王 波，任燕萍，張 樺,2

(1.新疆農業大學 農學院，烏魯木齊 830052；2.新疆農業大學 干旱區荒漠研究所，烏魯木齊 830052)

NAC(NAM， ATAF1/2， CUC2)是植物中特有的轉錄因子家族，其名稱來源于第一個被克隆的矮牽牛的NAM(no apical meristem)以及隨后在擬南芥中發現的 ATAF1、 ATAF2和CUC(cup-shaped cotyledon)的首字母縮寫[1-3]。目前，已經在擬南芥中發現117個NAC家族成員，水稻中則發現151個，它們均具有一個高度保守的N端DNA結合域，以及一個多樣的C端轉錄調控域[4]。研究發現NAC轉錄因子在植物多個生長發育過程中發揮重要作用，如促進種子萌發[5]、參與側根的形成[6-7]、延緩植物葉片衰老[8]以及調控纖維素合成[9]、次生壁生長[10-11]等。Ei等[12]從水稻中克隆得到一個與調控衰老和抽穗相關的基因 OsY37 (OryzasativaYellow37, ONAC011) ，并在 OsY37轉基因水稻和擬南芥植株中發現 OsY37是水稻生育期抽穗和衰老的正調控因子。張海娟等[13]發現蕪菁中 BcNAC2 基因在嫩角果中具有較高的表達豐度，組織原位雜交顯示在胚囊中 BcNAC2表達較高，故推測該NAC 轉錄因子可能與種子或胚的形成發育有關。同時，NAC轉錄因子還參與植物對各種非生物與生物脅迫的應答過程，棉花 GhATAF1基因可同時響應脫落酸(ABA)、低溫、鹽脅迫及黃萎病菌的誘導，過表達 GhATAF1不僅可以增強棉花對鹽脅迫的耐受性還會增加棉株對黃萎病菌和灰霉病菌的易感性[14]。大麥NAC轉錄因子 HvNAC6可以通過外源ABA處理增強野生型植株對于活體營養病原體白粉病的抗性[15]。三七(Panaxnotoginseng(Burk)F. H. Chen) 轉錄因子 PnNAC1可響應茉莉酸甲酯、乙烯利、水楊酸和過氧化氫幾種逆境相關信號分子，并參與三七對茄腐鐮刀菌和人參鏈格孢的防衛反應[16]。

梭梭[Haloxylonammodendron(C.A.Mey.)Bunge]是重要的荒漠建群種，在長期不斷適應極端氣候條件的生長進化過程中，產生了極強的抗干旱、抗高溫、抗嚴寒、耐鹽堿等特性[17]，形成了其獨特的抗逆分子機制。因此，研究梭梭NAC轉錄因子對分析梭梭抗逆分子機制和選育優良抗逆材料及荒漠化治理具有重要意義。植物生態適應性分子機制研究與應用前期通過梭梭干旱脅迫后轉錄組測序結果，克隆得到梭梭 HaNAC2基因(登錄號為KU534094)，其編碼的HaNAC2蛋白定位于細胞核中，同源分析結果顯示 HaNAC2屬于XNDⅠ亞組，且 HaNAC2啟動子包含多個與干旱誘導相關的MYB結合位點與逆境脅迫響應元件，說明該基因可能受到干旱、溫度和鹽等非生物脅迫的誘導[18-19]。本試驗在此基礎上，在不同非生物脅迫下分析 HaNAC2基因的表達模式，并在干旱、高溫和鹽脅迫下對 HaNAC2轉基因煙草的抗逆性進行分析，為進一步了解梭梭NAC轉錄因子在植物抵御逆境脅迫中的作用機制提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 試驗所用的梭梭種子采自于新疆吉木薩爾縣野生梭梭，煙草為普通煙草。

1.1.2 主要試劑TaqDNA聚合酶、dNTPs、 10×TaqBuffer、2/15K marker、T4DNA 連接酶、植物基因組DNA提取試劑盒均購于北京全式金生物公司；Trizol試劑購于天根生化科技有限公司；SYBR Premix 熒光定量PCR試劑盒購于life公司；NcoⅠ、SpeⅠ限制性內切酶及反轉錄試劑盒均購于TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒購于天根公司。共生培養基：MS培養基；篩選培養基：MS培養基+Kan (250 mg/L)+Cef (500 mg/L)；生根培養基：MS培養基+Cef (500 mg/L)。

1.1.3 菌株與質粒 大腸桿菌 DH5α感受態細胞、 pEASY-T1 Simple 克隆載體購于北京全式金生物公司；農桿菌菌株 EHA105和pCAMBIA 1304均為新疆農業大學農學院植物生物技術實驗室保存。

1.1.4 引物設計與合成 根據已知的 HaNAC2基因555 bp的ORF序列，用Primer 5.0設計梭梭 HaNAC2熒光定量引物和18S rRNA、 HaACT7內參基因[20]引物用于實時熒光定量PCR，兩端加有NcoⅠ和SpeⅠ酶切位點的特異性引物HaNAC2-1304-F/R和潮霉素引物HPT -F/R用于構建植物表達載體與轉基因煙草陽性檢測。引物合成與測序均由新疆昆泰瑞生物技術有限公司完成。引物序列如表1所示。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences of PCR

注:CCATGGNcoⅠ酶切位點; ACTAGTSpeⅠ酶切位點。

Note:CCATGGNcoⅠrestriction site; ACTAGTSpeⅠrestriction site.

1.2 試驗方法

1.2.1 脅迫處理 模擬地表高溫脅迫：選用正常生長的1 a生梭梭幼苗與同化枝約10 cm的梭梭幼苗分別進行不同處理。對1 a生梭梭幼苗進行模擬地表高溫脅迫，用加熱線在梭梭幼苗接觸土壤處控溫進行高溫脅迫，以30 ℃為對照，分別在40 ℃和55 ℃高溫脅迫24 h后恢復30 ℃，脅迫 0 h、2 h、12 h、24 h和恢復30 ℃后第3天、第6 天、第15 天時取樣；模擬干旱脅迫、高鹽脅迫及植物生長素(IAA)、脫落酸(ABA)處理：將同化枝約10 cm的梭梭幼苗的根系分別浸沒于質量分數為20% PEG6000溶液、200 mmol/L NaCl溶液、20 μmol/L IAA溶液及100 μmol/L ABA溶液中， 25 ℃分別處理0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h時取梭梭同化枝。取樣后液氮速凍，-80 ℃保存。

1.2.2 pCAMBIA1304- HaNAC2植物表達載體構建 以 HaNAC2基因的克隆質粒為模板，用設計好的帶酶切位點引物 HaNAC2-1304-F/R進行PCR，膠回收后與pEASY-T1 Simple連接，轉化大腸桿菌感受態細胞，挑取陽性克隆，待測序正確后，擴大培養提取質粒。用NcoⅠ和SpeⅠ限制酶分別對該目的基因質粒和pCAMBIA1304載體質粒進行雙酶切，切膠回收酶切產物，將 HaNAC2目的片段與pCAMBIA1304載體片段用T4DNA連接酶連接，轉化 DH5α大腸桿菌感受態細胞，轉化后的菌液涂布在含有Kan抗生素的LB固體培養基上，經菌液PCR鑒定和雙酶切鑒定后的陽性克隆送新疆昆泰瑞公司測序。

1.2.3 農桿菌介導法轉化煙草獲得陽性植株 取 EHA105農桿菌菌液在含Rif的YEB固體培養基上劃線活化，挑取單菌落擴大培養至OD600為0.6～0.8時，用預冷的CaCl2制備農桿菌感受態。利用熱激法將pCAMBIA1304-HaNAC2重組質粒轉入農桿菌感受態細胞中，轉化后的菌液涂布于含有50 μg/mL Kan和50 μg/mL Rif的YEB平板上，28 ℃倒置培養24～36 h。挑取生長出的單菌落至1 mL含有50 μg/mL Kan和50 μg/mL Rif的YEB液體培養基，28 ℃震蕩培養后菌液PCR鑒定篩選出陽性菌落。

經陽性鑒定的農桿菌進行根癌農桿菌培養，通過農桿菌侵染轉化預培養的煙草葉片，置于共生培養基上28 ℃避光條件下共培養2 d。之后轉移到篩選培養基上，25 ℃光照條件下進行篩選培養，待煙草不定芽長出后，小心切下小芽繼續放在篩選培養基中進行繼續培養。待不定芽長到 4 cm以上或5片葉時，將煙草從篩選培養基轉移到煙草生根培養基上進行生根培養。當轉基因煙草幼苗根系長大健全后，進行煉苗移栽。獲得T0代轉基因煙草植株，提取基因組DNA，以HaNAC2-1304-F/R特異性引物和HPT -F/R潮霉素引物進行PCR，篩選出T0代陽性轉基因煙草植株。

1.2.4 轉基因煙草陽性植株的篩選與表達分析 收獲T1代轉基因煙草種子，種植于土中，提取基因組DNA和總RNA，DNA繼續采用“1.2.3”的方法進行PCR鑒定陽性植株，將總RNA反轉錄為cDNA。以cDNA為模板，用HaNAC2-F/R和HaACT7-F/R引物進行半定量PCR，分析T1代植株中 HaNAC2基因的表達情況。

1.2.5 脅迫處理后表型觀察 用野生型煙草與“1.2.3”和“1.2.4”中鑒定的 HaNAC2轉基因煙草植株種子進行正常條件下與模擬干旱條件下的發芽試驗，分別將野生型與 HaNAC2轉基因煙草種子點在鋪有濾紙的培養皿中進行發芽培養，每個株系100粒種子。正常條件下發芽的對照組用蒸餾水保持培養皿中的濾紙濕潤，模擬干旱的處理組每天用質量分數為20% PEG6000保持培養皿中的濾紙濕潤，觀察統計每天的發芽率，3個生物學重復。

挑選正常生長至6周齡大小長勢均一的野生型和 HaNAC2轉基因煙草幼苗，進行澆足水后不再澆水的自然干旱脅迫，觀察煙草植株和根系表型變化；取相同部位大小均一的野生型和 HaNAC2轉基因煙草葉片，于48 ℃光照培養箱中進行高溫脅迫處理，觀察煙草葉片表型變化并統計葉片失水率情況；將長勢均一的野生型和 HaNAC2轉基因煙草幼苗根系浸于250 mmol/L NaCl溶液中進行鹽脅迫處理，觀察脅迫后煙草植株表型變化。

1.2.6 生理指標測定 取野生型和 HaNAC2轉基因煙草幼苗葉片，在質量分數為20% PEG6000溶液和48 ℃光照培養箱中進行模擬干旱與高溫脅迫處理，觀察脅迫后野生型和 HaNAC2轉基因煙草葉片表型變化。分別在脅迫0 h、6 h、12 h、24 h后取其葉片，以0 h為未脅迫對照，參考李合生[21]的酸性茚三酮法和蒽酮法測定脯氨酸和可溶性糖的質量分數，進行3個生物學重復。

2 結果與分析

2.1 實時熒光定量PCR分析 HaNAC2表達 模式

實時熒光定量PCR分析梭梭 HaNAC2基因在模擬地表高溫脅迫、質量分數為20% PEG6000溶液模擬干旱脅迫、200 mmol/L NaCl高鹽脅迫、20 μmol/L IAA及100 μmol/L ABA處理下的表達模式。在根中40 ℃的脅迫24 h無明顯表達，在恢復 30 ℃后 HaNAC2的表達量在第3天開始上調，15 d達到最大；55 ℃脅迫2 h達到最大，在恢復30 ℃第6天到脅迫前水平，根中 HaNAC2對55 ℃的地表高溫響應更迅速(圖1-A)。在同化枝中 40 ℃和55 ℃脅迫后 HaNAC2的表達量在脅迫后恢復第3天達到最大值，之后表達量下調又恢復到脅迫前水平，同化枝中 HaNAC2對40 ℃的地表高溫響應更迅速(圖1-B)。在質量分數為20% PEG6000溶液模擬干旱脅迫下，隨著脅迫時間的增加， HaNAC2在脅迫12 h時表達量達到最大，之后恢復到脅迫前水平(圖1-C)；在200 mmol/L NaCl溶液的高鹽脅迫下，隨著脅迫時間的增加， HaNAC2在脅迫1 h時表達量達到最大，之后表達量下調(圖1-D)；在20 μmol/L IAA溶液處理下，隨著處理時間的增加， HaNAC2的表達量在6 h達到最大，之后恢復到處理前水平(圖1-E)；在100 μmol/L ABA溶液處理下，隨著處理時間的增加， HaNAC2在1 h表達量下調，之后表達量上調，在12 h達到最大(圖1-F)。結果表明 HaNAC2基因均能響應模擬地表高溫脅迫、模擬干旱脅迫、高鹽脅迫及IAA、ABA處理。

A.模擬地表高溫脅迫(根) Simulated surface heat stress(root); B.模擬地表高溫脅迫(同化枝) Simulated surface heat stress(branch); C.模擬干旱脅迫 Simulated drought stress;D.高鹽脅迫 High salt stress;E.IAA處理 IAA Treatment; F.ABA處理 ABA treatment; *代表差異達顯著水平(P<0.05) Represents significant difference (P<0.05); **代表差異達極顯著水平 (P<0.01) Represents extremely significant difference(P<0.01)

圖1 不同脅迫處理下 HaNAC2的表達模式
Fig.1 Expression pattern of HaNAC2 under different stress treatments

2.2 植物表達載體構建及轉化

為了研究梭梭 HaNAC2基因在植物抵御逆境脅迫中的作用，構建pCAMBIA1304- HaNAC2植物表達載體，通過NcoⅠ和SpeⅠ雙酶切鑒定(圖2)，測序成功的重組質粒轉入 EHA105農桿菌中進行驗證，葉盤法轉化煙草葉片。

2.3 轉基因煙草陽性植株篩選與表達分析

以pCAMBIA1304- HaNAC2重組質粒為陽性對照(+)，野生型煙草DNA和水做陰性對照(-)，用特異性引物HaNAC2-1304-F/R(555 bp)和潮霉素引物HPT -F/R(812 bp)對T0代和T1代 HaNAC2轉基因煙草進行陽性篩選，結果顯示T0代煙草中都轉入了 HaNAC2基因，T1代煙草中篩選出1、2、5、7陽性株系(圖3)。用HaNAC2-F/R和HaACT7-F/R為引物對4個T1代陽性轉基因煙草中 HaNAC2的表達進行半定量分析，結果發現4個T1代陽性轉基因煙草株系中1、2、5表達量較高(圖4)。

2.4 HaNAC2轉基因煙草脅迫后表型分析

取T1代 HaNAC2轉基因煙草中表達量較高的L1、L2、L5株系的種子與野生型煙草種子，在正常條件下和質量分數為20% PEG6000模擬干旱脅迫下進行萌發，并統計其發芽率，結果發現在正常條件下 HaNAC2轉基因煙草較野生型煙草萌發時間推遲，且發芽率低于野生型煙草(圖5-A)，而在質量分數為20% PEG6000模擬干旱脅迫下 HaNAC2轉基因煙草萌發時間提前，且發芽率顯著高于野生型煙草(圖5-B)。6周齡的野生型煙草和 HaNAC2轉基因煙草幼苗在干旱脅迫8 d后野生型煙草比轉基因煙草明顯萎蔫(圖5-C)，且 HaNAC2轉基因煙草相比野生型煙草具有更發達的側根(圖5-D)； 48 ℃高溫培養箱中脅迫處理8 h后，野生型煙草葉片較 HaNAC2轉基因煙草葉片明顯萎蔫(圖5-E)，且隨著高溫脅迫時間的增加野生型煙草葉片的失水率顯著高于 HaNAC2轉基因煙草葉片(圖5-G)；250 mmol/L NaCl溶液中鹽脅迫處理8 h后，野生型煙草植株明顯萎蔫，而 HaNAC2轉基因煙草萎蔫程度較輕(圖5-F)。綜上所述， HaNAC2轉基因煙草在干旱、高溫、鹽脅迫下的表型變化都明顯優于野生型煙草，表明 HaNAC2轉基因煙草 比野生型煙草具有更強的抗旱性、耐熱性與耐 鹽性。

M1.2K Marker; M2.15K Marker; 1.pCAMBIA1304- HaNAC2重組質粒 pCAMBIA1304- HaNAC2 recombinant plasmid

圖2 重組質粒雙酶切鑒定
Fig.2 Identification of recombinant plasmid by double enzyme digestion

A. HaNAC2-1304-F/R引物 HaNAC2-1304-F/R primer; B.HPT -F/R引物 HPT -F/R primer; M.2K Marker 2K Marker; +.陽性對照 Positive control; - .陰性對照 Negative control; 1～7. HaNAC2轉基因植株 HaNAC2 transgenic plants

圖3 HaNAC2轉基因煙草陽性篩選
Fig.3 Positive screening of HaNAC2transgenic tobacco

1、2、5、7編號同圖3 Numbers 1,2,5 and 7 are the same as Fig.3

圖4 HaNAC2轉基因煙草半定量PCR分析
Fig.4 RT-PCR analysis of HaNAC2transgenic tobacco

2.5 HaNAC2轉基因煙草脅迫后生理指標分析

在質量分數為20% PEG6000模擬干旱脅迫下和48 ℃高溫脅迫下測定各株系煙草的生理指標，結果顯示 HaNAC2轉基因煙草中脯氨酸和可溶性糖質量分數逐漸升高且上升幅度明顯高于野生型煙草(圖6)。脯氨酸和可溶性糖的質量分數與植物對逆境脅迫的抵抗能力正相關，說明梭梭 HaNAC2基因提高了煙草的抗旱性與耐熱性。

A.正常條件下的發芽率 Germination rate under normal condition; B.模擬干旱條件下的發芽率 Germination rate under simulated drought conditions; C.干旱脅迫下植株表型變化 Phenotypic changes of plants under drought stress; D.干旱脅迫后根系生長情況 Root growth after drought stress; E.高溫脅迫下葉片表型變化 Phenotypic changes of leaves under high temperature stress; F.高鹽脅迫下植株表型變化 Phenotypic changes of plants under high salt stress; G.高溫脅迫下葉片失水率 Leaf water loss rate under high temperature stress

圖5 HaNAC2轉基因煙草表型鑒定
Fig.5 Phenotypic identification of HaNAC2transgenic tobacco

3 討論與結論

經過長期進化的過程，植物遇逆境脅迫時會從分子、細胞、生理和生化水平上做出適應性調整，以抵御和適應外部環境因子的脅迫，因此形成了高效的脅迫應答機制，此過程中轉錄因子發揮著關鍵的調控作用[22]。非生物脅迫往往會引起植物體內生理指標的變化，如脯氨酸質量分數、可溶性糖質量分數都可以作為衡量植物抗逆性的生理指標。脯氨酸和可溶性糖為小分子的滲透調節物質，在維持植物體內水分平衡方面起到重要作用，植物在正常生長時脯氨酸質量分數較少，當干旱、高溫脅迫時植物中的脯氨酸質量分數則顯著增加[23]，脯氨酸有保護脅迫下細胞內大分子穩定性的作用[24]；趙江濤等[25]在研究可溶性糖的生理作用時發現，其參與干旱脅迫時的滲透調節過程、復水后的生理恢復和修復過程；脯氨酸和可溶性糖的質量分數與植物對逆境脅迫的抵抗能力正相關。

作為植物中最大的轉錄因子家族之一，NAC家族中的大多數成員都是誘導型表達的轉錄因子，植物不同生長發育階段、病原體侵染、高鹽、干旱、低溫、植物激素刺激和機械損傷等生物與非生物脅迫都可誘導其表達[26]。甘藍中 BoNAC019可能通過誘導ABA分解代謝基因和降低ABA質量分數而參與調控植物的抗旱性， BoNAC019基因可響應干旱、鹽、ABA及H2O2等非生物脅迫處理[27]。鷹嘴豆 CarNAC4受干旱、高鹽、高溫、低溫及ABA、IAA、MeJa和H2O2的誘導表達，過表達 CarNAC4的轉基因擬南芥植株抗旱性與耐鹽性得以提高[28]。研究發現一些梭梭HaNACs在模擬干旱及鹽脅迫下具有多樣的表達模式，它們可能參與鹽和干旱脅迫應答、調節過程，其中 HaNAC1的過表達使轉基因馬鈴薯的抗旱性與耐鹽性提高，HaNAC1可能是通過調節一些與脅迫響應相關基因的表達，調控激素表達水平變化從而提高馬鈴薯的抗旱性[29-31]。本研究分析發現在模擬地表高溫、模擬干旱、高鹽及IAA和ABA脅迫處理下 HaNAC2基因的表達量顯著上調，且過表達梭梭 HaNAC2的轉基因煙草在干旱和高溫、高鹽脅迫下具有更強的抗旱、耐熱與耐鹽的表型，在受到干旱、高溫逆境脅迫后， HaNAC2基因過表達煙草葉片中積累了大量的脯氨酸和可溶性糖，其質量分數顯著高于野生型煙草，表明 HaNAC2的過表達導致滲透調節物質質量分數的增加，使植株維持較為穩定的滲透勢，從而抵御干旱和高溫脅迫的損傷。同時發現轉 HaNAC2基因煙草有更發達的根系，推測 HaNAC2基因可能與側根發育有關。由于一個特定的NAC轉錄因子往往同時涉及多個發育或應對多個逆境因子脅迫過程[32]，預示著 HaNAC2可能參與多種信號傳遞，并與側根發育和干旱、高溫及鹽逆境響應有關。

A.干旱脅迫下脯氨酸質量分數 Proline mass fraction under drought stress; B.高溫脅迫下脯氨酸質量分數 Proline mass fraction under high temperature stress; C.干旱脅迫下可溶性糖質量分數 Soluble sugar mass fraction under drought stress; D.高溫脅迫下可溶性糖質量分數 Soluble sugar mass fraction under high temperature stress

圖6 HaNAC2轉基因煙草生理生化指標
Fig.6 Physiological and biochemical indexes of HaNAC2 transgenic tobacco