厭氧氨氧化顆粒污泥的擴(kuò)培及菌種鑒定

□文/劉 鵬 張軼凡 孫曉瑩 楊貝貝 聶英進(jìn)

厭氧氨氧化（ANAMMOX）是指在厭氧或缺氧條件下，由一類浮霉菌門細(xì)菌以亞硝酸鹽為電子受體，以銨鹽為電子供體，反應(yīng)生成氮?dú)饧吧倭肯跛猁}的過程[1～3]。與傳統(tǒng)生物脫氮工藝相比，厭氧氨氧化具有不需投加有機(jī)碳源、減少60%以上的曝氣能耗、剩余污泥產(chǎn)量少等優(yōu)點(diǎn)[4]。但是厭氧氨氧化菌生長(zhǎng)速率僅為0.002 7 h-1，倍增時(shí)間長(zhǎng)達(dá)10～12 d[5]對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求極其嚴(yán)苛，DO[6]、氨氮[7]、亞硝態(tài)氮[7]等因素均會(huì)影響菌的活性，制約了厭氧氨氧化技術(shù)在水處理中的應(yīng)用；顆粒污泥具有生物組成多樣、沉降性能良好、抗水質(zhì)波動(dòng)能力強(qiáng)等特點(diǎn)，培養(yǎng)出含厭氧氨氧化菌的顆粒污泥，將有利于后續(xù)工藝研究和工程應(yīng)用，尤其是對(duì)氨氮含量高，僅靠傳統(tǒng)生化處理難以實(shí)現(xiàn)達(dá)標(biāo)排放的高濃度污水，如污泥厭氧消化后產(chǎn)生的厭氧消化沼液和垃圾轉(zhuǎn)運(yùn)、焚燒和填埋過程中產(chǎn)生的垃圾滲濾液等[8]的處理。有研究[9]采用UASB 反應(yīng)器對(duì)厭氧氨氧化顆粒污泥進(jìn)行培養(yǎng)，試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)得到的顆粒污泥密度低且容易流失；也有研究利用SBR反應(yīng)器對(duì)厭氧氨氧化顆粒污泥進(jìn)行培養(yǎng)，卻發(fā)現(xiàn)該方法有總氮去除負(fù)荷低于2.0 kg/(m3·d)的缺點(diǎn)[10～11]。

綜上所述，開發(fā)一種總氮去除負(fù)荷高、顆粒污泥生長(zhǎng)穩(wěn)定的擴(kuò)培方法具有重要意義。

1 試驗(yàn)思路

以厭氧氨氧化顆粒污泥作為接種污泥，在發(fā)酵罐中以SBR 方式操作，由配水來提供主營(yíng)養(yǎng)成分及微量元素；根據(jù)顆粒污泥的脫氮效能，隨時(shí)調(diào)整進(jìn)水中氨氮和亞硝態(tài)氮的濃度，逐漸提高體系的總氮負(fù)荷，使厭氧氨氧化顆粒污泥逐漸適應(yīng)進(jìn)水水質(zhì)的變化，避免基質(zhì)累積產(chǎn)生抑制作用；摸索出總氮去除負(fù)荷高，顆粒污泥增長(zhǎng)穩(wěn)定的擴(kuò)培方法，為后續(xù)的工藝設(shè)計(jì)、中試及現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)提供基礎(chǔ)。通過對(duì)擴(kuò)培后的顆粒污泥進(jìn)行高通量測(cè)序，可以鑒定顆粒污泥中包含的菌種及其功能，確定厭氧氨氧化菌在顆粒污泥中所占的比例，證明該擴(kuò)培方法的有效性。

2 材料與方法

2.1 接種污泥及配水組成

在天津某大學(xué)試驗(yàn)室內(nèi)，從6 L容積的UASB反應(yīng)器中取出2 L 厭氧氨氧化顆粒污泥為接種污泥，污泥濃度為20 000 mg/L，取出時(shí)總氮負(fù)荷為15 kg/(m3·d)；接種后，顆粒物泥濃度為800 mg/L，因此在擴(kuò)培初期需要降低總氮負(fù)荷，在顆粒污泥馴化及增長(zhǎng)的過程中，根據(jù)出水水質(zhì)和總氮去除效率，逐步提高總氮負(fù)荷。

擴(kuò)培過程所消耗的化學(xué)試劑分為主營(yíng)養(yǎng)成分和微量元素兩大類。其中，主營(yíng)養(yǎng)成分選用的試劑為工業(yè)級(jí)，微量元素選擇分析純的試劑。除EDTA外，試劑中均不含有機(jī)成分，避免異養(yǎng)菌大量繁殖對(duì)厭氧氨氧化菌產(chǎn)生抑制作用，所有試劑均從天津闊希環(huán)保科技有限公司直接購(gòu)買并按表1的濃度配制好后使用。

表1 主營(yíng)養(yǎng)成分與微量元素濃縮液配方[12]

2.2 試驗(yàn)裝置

擴(kuò)培裝置為上海百侖生物科技有限公司生產(chǎn)的HC014 不銹鋼發(fā)酵罐。其有效容積為50 L，內(nèi)徑0.65 m，高徑比2.63。見圖1。

圖1 厭氧氨氧化顆粒污泥擴(kuò)培裝置

以SBR的方式進(jìn)行操作，每個(gè)換水周期為24 h，排水前需靜置1 h，待顆粒污泥沉降后，排出上清液40 L，再進(jìn)水到40 L 并加入微量元素濃縮液。將10 L 主營(yíng)養(yǎng)成分母液用蠕動(dòng)泵連續(xù)滴加23 h并不斷攪拌。發(fā)酵罐需密封并且避光，防止溶氧和光照對(duì)顆粒污泥的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制。罐體自帶加熱及保溫裝置，可將水的溫度控制在（35±1）℃，pH控制在7.8～8.5，反應(yīng)過程中需要觀察pH的變化并補(bǔ)加稀硫酸，厭氧氨氧化產(chǎn)生的氮?dú)饨尤氲綒怏w流量計(jì)中（型號(hào)為L(zhǎng)MF-1，購(gòu)自天津闊希環(huán)保科技有限公司）。由于顆粒污泥不斷產(chǎn)生氮?dú)猓械娜芙庋酰―O）逐漸被排出，DO 值降低到0，發(fā)酵罐中可穩(wěn)定維持厭氧環(huán)境。

2.3 測(cè)試項(xiàng)目與分析方法

氨氮（NH4+-N）采用納氏試劑分光光度法測(cè)定，亞硝態(tài)氮（NO2—-N）采用 N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法測(cè)定，硝態(tài)氮（NO3—-N）采用酚二磺酸分光光度法測(cè)定，總氮（TN）采用過硫酸鉀氧化分光光度法測(cè)定，混合液懸浮固體濃度（MLSS）采用重量法進(jìn)行測(cè)定[13]。總氮負(fù)荷（NLR）、總氮去除負(fù)荷（NRR）及TN去除率由文獻(xiàn)[14]中的公式計(jì)算得出。水的pH、溫度和DO由發(fā)酵罐自帶的電極進(jìn)行測(cè)定。由北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行16 s RNA高通量測(cè)序，對(duì)厭氧氨氧化菌的含量進(jìn)行測(cè)定并鑒定出顆粒污泥所包含的微生物。

3 結(jié)果與討論

運(yùn)輸途中，厭氧氨氧化顆粒污泥的活性可能下降；因此，剛接種到發(fā)酵罐的顆粒污泥需要時(shí)間恢復(fù)活性并適應(yīng)新環(huán)境。在擴(kuò)培初期，先降低體系的總氮負(fù)荷，防止因厭氧氨氧化菌的活性下降導(dǎo)致進(jìn)水中的基質(zhì)累積，對(duì)菌的活性和生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。由反應(yīng)方程可知，厭氧氨氧化反應(yīng)需保證進(jìn)水中NO-2-N/NH+4-N的摩爾比在1.32∶1左右。

各測(cè)試項(xiàng)目隨時(shí)間的變化情況見圖2。

圖2 各測(cè)試項(xiàng)隨時(shí)間變化情況

啟動(dòng)階段，NLR 由0.2 kg/（m3·d）逐漸提升到0.8 kg/（m3·d），此時(shí)進(jìn)水NH+4-N、NO-2-N 的濃度分別為314、406 mg/L，NO-2-N/NH+4-N為1.29∶1；根據(jù)出水水質(zhì)和TN 去除效率，判斷顆粒污泥的活性，從而調(diào)整進(jìn)水水質(zhì)（NH+4-N和NO-2-N的濃度）；該階段目的是使顆粒污泥恢復(fù)活性，適應(yīng)擴(kuò)培環(huán)境，共持續(xù)40 d左右；在啟動(dòng)階段，NLR、NRR 和TN、NH+4-N 和NO-2-N 去除率，進(jìn)出水水質(zhì)均存在波動(dòng)；NRR 與NLR 的變化趨勢(shì)一致；當(dāng)NLR提高速度快時(shí)，出水中NH+4-N和NO-2-N的濃度也升高，NO-3-N 出現(xiàn)累積，此時(shí)的TN 去除率明顯降低，顆粒污泥的活性被抑制。需要及時(shí)排水，降低進(jìn)水的NLR，讓顆粒污泥恢復(fù)活性，適應(yīng)水質(zhì)變化后再逐漸提高NLR，可將TN去除率恢復(fù)到80%以上。

經(jīng)過40 d 的啟動(dòng)及適應(yīng)期后，顆粒污泥適應(yīng)了環(huán)境，到擴(kuò)培第80 d時(shí)，NLR已經(jīng)提高到1.5 kg/(m3·d)，此時(shí)進(jìn)水中NH+4-N、NO-2-N 的濃度分別為831、1 033 mg/L，NO-2-N/NH+4-N為1.24∶1；出水中NH+4-N、NO-2-N的濃度分別為 20、28 mg/L，NH+4-N 和NO-2-N 的去除率達(dá)90%以上；當(dāng)出水中NO-3-N的濃度升高到254 mg/L時(shí)，NO-3-N/NH-N 為 0.30，接近 0.26 的理論值，TN 去除率仍達(dá)80%以上，證明顆粒污泥正在進(jìn)行厭氧氨氧化且活性較高。第80 d 時(shí)，測(cè)得顆粒污泥的MLSS 為6 000 mg/L，與剛接種時(shí)MLSS為800 mg/L 相比，擴(kuò)培效果明顯。需額外注明的是，第45 d 時(shí)，圖 2a、c、d 中出現(xiàn)的異常波動(dòng)，是由pH控制誤差導(dǎo)致，糾正后未再現(xiàn)。

到 106 d 時(shí)，NLR 已升高至 3.5 kg/(m3·d)，進(jìn)水中NH+4-N、NO-2-N 的濃度分別為1 597、2 038 mg/L，NO-2-N/NH+4-N 為 1.28：1；出水中NH+4-N 濃度為 7.1 mg/L，NO-2-N 的濃度為 15.4 mg/L，NO-3-N 濃度為 429 mg/L，NO-3-N/NH-N為0.27。顆粒污泥正在進(jìn)行厭氧氨氧化反應(yīng)，TN 去除率在80%以上，NO-3-N 是由反應(yīng)生成，沒有抑制顆粒污泥的活性。體系的NRR 已經(jīng)提高到3.38 kg/（m3·d），克服了采用SBR法擴(kuò)培NRR難以達(dá)到2.0 kg/（m3·d）的缺點(diǎn)[10～11]。第106 d 時(shí)，測(cè)得顆粒污泥的 MLSS 為 11 300 mg/L，對(duì)比第 80 d 時(shí)的 6 000 mg/L，在26 d 內(nèi)污泥濃度增加了5 300 mg/L。第100 d 時(shí)出現(xiàn)的NLR降低為停電導(dǎo)致的反應(yīng)暫停，通電后擴(kuò)培恢復(fù)正常。

從發(fā)酵罐中取出顆粒污泥進(jìn)行觀察，其為紅色，顆粒直徑在0.2～1 cm 之間，形狀不規(guī)則。對(duì)顆粒污泥進(jìn)行16 s RNA高通量測(cè)序，可以得到微生物的種類和含量，見圖3。

其中：Candidatus Kuenenia 菌為目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的10 種 Anammox 菌之一[15]，屬于浮霉菌門，是污水處理系統(tǒng)中常見的優(yōu)勢(shì)厭氧氨氧化菌，其比例占到了整個(gè)顆粒污泥微生物數(shù)量的11%；顆粒污泥中還有19%的反硝化菌（Denitrotisoma）[15]，它與厭氧氨氧化菌共生，可提高TN去除效果，減輕反應(yīng)過程中NO-N的累積對(duì)厭氧氨氧化菌的抑制作用；1%的氨氧化菌（AOB，Nitrosomonas）[15]可將NH4+-N 氧化為NO-N，但由于擴(kuò)培是在厭氧條件下運(yùn)行，所以氨氧化菌含量很小，NO-2-N是由配水提供；亞硝態(tài)氮氧化菌（NOB，Nitrospira）[15]在顆粒污泥中沒有檢出，說明在厭氧環(huán)境下，出水中的NO-3-N是由厭氧氨氧化反應(yīng)生成；異養(yǎng)菌（Chloroflexi，數(shù)量約占顆粒污泥的23%）可去除體系中的有機(jī)成分（如進(jìn)水中的EDTA 以及厭氧氨氧化菌等產(chǎn)生的細(xì)胞分泌物和胞外聚合物），避免其他異養(yǎng)菌大量繁殖，同時(shí)也有助于顆粒污泥的成形[15]。

圖3 厭氧氨氧化顆粒污泥的外觀及菌種鑒定

4 結(jié)論

1）以厭氧氨氧化顆粒污泥為接種物，以SBR 的操作方式在50 L 發(fā)酵罐中進(jìn)行擴(kuò)培試驗(yàn)。通過監(jiān)測(cè)進(jìn)出水水質(zhì)，根據(jù)TN去除效果調(diào)整進(jìn)水中氨氮和亞硝態(tài)氮的濃度，可提高厭氧氨氧化顆粒污泥抗水質(zhì)波動(dòng)的能力，適應(yīng)擴(kuò)培體系并穩(wěn)定生長(zhǎng)。

2）在106 d 內(nèi)，厭氧氨氧化顆粒污泥的濃度從接種時(shí)的800 mg/L 增長(zhǎng)到11 300 mg/L，顆粒污泥呈現(xiàn)紅色，大小在0.2～1 cm 之間，總氮去除負(fù)荷達(dá)到3.38 kg/(m3·d)，TN去除率穩(wěn)定在80%以上。

3）通過16 sRNA高通量測(cè)序，Candidatus Kuenenia菌在顆粒污泥中的數(shù)量比為11%，該菌為常見的厭氧氨氧化優(yōu)勢(shì)菌之一。反硝化菌、異養(yǎng)菌和厭氧氨氧化菌共生，能夠增強(qiáng)顆粒污泥抗硝態(tài)氮和有機(jī)成分累積的能力，提升TN去除效果。

文中所述方法能夠穩(wěn)定、高效的對(duì)厭氧氨氧化顆粒污泥進(jìn)行擴(kuò)培，克服了SBR反應(yīng)器總氮去除負(fù)荷低的缺點(diǎn)，為厭氧氨氧化工藝開發(fā)和實(shí)際應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。