球磨生物炭的性質及其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的毒性效應研究

郭賽賽，劉小妹，陳宏坤，莊志成，王宜志，唐景春，4*

（1.南開大學環境科學與工程學院，天津 300071；2.石油石化污染物控制與處理國家重點實驗室，中國石油集團安全環保技術研究院，北京 102206；3.天津天邁節能設備有限公司，天津 300112；4.天津市城市環境污染診斷與修復工程技術中心，天津300071）

由于生物炭（BC）優異的物理化學性質，包括巨大的表面積、大量的孔隙結構，其已被廣泛用于環境修復中。針對BC對微生物毒性影響的研究還未見報道，但有研究表明BC施于土壤后，會引起微生物群落的變化[1-2]。施用BC可以增加土壤養分和穩定碳的含量[3-6]，從而為微生物提供更多的底物，提高微生物的豐度；BC在土壤中的應用也為微生物提供了一個安全的棲息地[7]。所以在經過BC改良的土壤中，微生物的數量和活性會有所增加，這也導致土壤微生物群落和酶活性發生顯著變化[8]。但是BC對某種具體微生物的影響尚不清楚。Chen等[9]在中國桐鄉市進行了大田試驗，研究了稻草BC對土壤養分和微生物特性的影響，研究發現施用20%BC與對照相比，土壤細菌數量增加了26.9%；施用10%以上的BC，放線菌數量顯著增加80.6%～130%，但是真菌數量減少22.2%～30.2%，枯草桿菌數量減少42.4%～54.4%。另外Qiao等[10]在受砷污染的稻田土上進行實驗，發現BC增加了砷和鐵相關細菌的豐度，但對其他菌群的影響尚不清楚。

球磨生物炭（BM）是由高溫裂解后的BC在球磨機中通過機械力作用，將BC粒徑減小到納米或者微米級別的新型生物炭材料[11]。這種新型材料由Peter?son等[11]在2012年提出。由于它比BM具有更好地吸附[12]和降解[13]性能，而經常被用于去除水體和土壤中的污染物。之前的研究證明了BM具有更大的比表面積[11]和更多的酸性官能團。近年來，關于BM的研究多集中在它的吸附降解性能[14]，很少有研究關注它對微生物的毒性。但是，根據以往的研究[15]，達到納米級別的BC很有可能對微生物產生毒性效應。另外，之前的研究[16-17]證明了碳納米材料都存在一定的毒性，如氧化石墨烯[18-20]、碳納米管[21]、富勒烯[22-23]等。

已有研究表明，自由基的產生是納米材料對微生物毒性作用的重要方式[24]。自由基或產生的活性氧可以與許多化學結構分子發生反應，包括生物大分子，如糖蛋白會導致細胞膜失穩和細胞死亡。在水相中，這些自由基可以觸發活性氧自由基（ROS）的產生。研究發現，中、高濃度的ROS通過細胞氧化應激反應誘導細胞凋亡甚至導致其壞死[25-27]，低濃度的ROS更廣泛的生理意義在于其對轉錄因子的激活以及對細胞增殖、分化的促進[25]。Lieke等[28]對500℃水稻秸稈BC研究發現，存在于BC中的自由基對線蟲神經毒性產生影響。此外，Liao等[29]和Farhangi-Abriz等[30]證明了BC顆粒中的自由基在水中可以促進活性氧的產生，并對植物的種子萌發以及根和莖伸長產生不利的影響。BM經球磨后，材料粒度大幅降低，部分可以達到納米尺度，因此有理由認為BM有一定程度的納米毒性效應。

到目前為止，關于BM對細菌的毒性影響尚未有人研究。基于此，本研究以小麥秸稈為原料，在500℃下制備得到BM，通過行星式球磨儀制備球磨生物炭材料。對其性質進行研究，同時選取兩種模式細菌進行急性毒性實驗，利用熒光法測定細菌的ROS和存活率等指標，并利用掃描電子顯微鏡（SEM）和激光共聚焦顯微鏡（LSCM）觀察細菌的形態，對BM的微生物毒性和抗菌機理進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 實驗原料

實驗所用的生物炭原料為小麥秸稈，來源于天津周邊農村。BC由小麥秸稈在馬弗爐中500℃限氧裂解2.5 h制備而成[31]，BM由生物炭按照Lyu等[14]的方法制備而成。大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 25923為實驗室保存菌種。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的培養均采用LB培養基（胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物 5 g·L-1，氯化鈉 10 g·L-1），在 30 ℃、180 r·min-1條件下，于搖床中培養12 h至對數生長期。

1.2 BC的表征

對制備的BC和BM進行清洗處理：將BC和BM置于蒸餾水中浸泡一周，并用磁力攪拌器（84-B，山東菏澤正虹科教儀器有限公司，中國）攪拌，每隔6 h倒掉漂浮在水面上的雜質，再加入等量的蒸餾水進行清洗。將清洗好的BC和BM進行抽濾，置于恒溫干燥箱（DGG-9023A，上海優浦科學儀器公司，中國）中，于80℃下干燥24 h，裝入塑封袋密封，備用。采用多站擴展式全自動快速比表面儀（ASAP 2460，麥克公司，美國）測定BC和BM的比表面積；采用掃描電子顯微鏡（JSM-7800F，日本電子，日本）觀測BC和BM的表面形貌；采用傅里葉變換紅外光譜儀（TEN?SOR 37，BRUKER，德國）分析BC和BM的官能團；采用pH計（PB-10，Sartorius，德國）測定pH值；采用電導率儀[FE30，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，中國]測定電導率值。

1.3 急性毒性實驗

將50 mL培養至對數生長期的E.coli和S.aureus轉移至50 mL無菌離心管中，5000 r·min-1離心5 min，倒掉上清液，用無菌0.9%NaCl清洗3次以除去殘留的LB培養基。將清洗完的菌種倒入50 mL分別加入了0、10、20、50、100、200 mg·L-1BC和BM的無菌LB培養基和0.9%NaCl中，置于搖床（HNY-2102C，歐諾公司，中國）里，30℃、180 r·min-1培養2.5 h后，分析其毒性影響。

1.4 細菌形貌觀測

取50 mL染毒后的菌液，5000 r·min-1離心5 min后，去除上清液。將菌體放到2.5%的戊二醛（掃描電鏡專用）中，4℃固定4 h（或固定過夜）。將固定液倒掉，0.1 mol·L-1PBS緩沖液（pH7.0）漂洗3次，每次15 min。利用濃度為30%、50%、70%、80%、90%的乙醇進行梯度脫水，每次15 min，隨后用無水乙醇處理兩次，每次20 min。真空干燥后在菌體表面噴金，置于SEM下觀察細胞形態。

1.5 細菌存活率測定與LSCM觀測

存活率采用細菌細胞活性測定試劑盒（Invitro?gen，美國）測定[24]。染料為PI和SYTO 9，PI只能穿過破損的細胞膜，與細胞核結合顯紅色熒光；SYTO 9可以穿過所有細胞膜，與細胞核結合顯綠色熒光。當兩種染料同時存在時，活細胞呈現綠色，死細胞呈現紅色。取1 mL染毒后的菌液置于2 mL離心管中，10 000 r·min-1離心3 min，用無菌0.9%NaCl清洗3次，取100 μL PI和SYTO 9等量混勻后的染料與100 μL菌液混合，錫箔紙包好后置于搖床中，于30℃，180 r·min-1混合搖勻15 min，取100 μL樣品于96微孔板中，用全功能酶標儀（Synergy H4，伯騰公司，美國，激發波長485 nm，發射波長521 nm）測定熒光值，計算存活率。另取50 μL樣品用LSCM（LSM880 with Airyscan，Zeiss公司，德國）觀測。

1.6 細菌ROS測定

用活性氧試劑盒（碧云天，中國）測定細菌細胞內的ROS含量[24]，染料為2′，7′-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）。DCFH-DA向細胞內擴散，脫去乙酰基成為不顯熒光的DCFH，細胞內的ROS迅速將DCFH氧化成具有高強度熒光的DCF，其熒光強度和細胞內的ROS含量成正比。取1 mL染毒后的菌液置于2 mL離心管中，10 000 r·min-1離心3 min，用無菌0.9%NaCl清洗3次后，取100 μL活性氧染料與100 μL菌液混合，錫箔紙包好后置于搖床中，于30℃、180 r·min-1混合搖勻30 min，取100 μL樣品于96微孔板中，用酶標儀（激發波長485 nm，發射波長521 nm）測定熒光值。相對ROS水平表示為樣品組與空白對照組的熒光強度之比[26]。

消除ROS實驗：將培養至對數期的菌體清洗干凈后，倒入50 mL 0.9%NaCl中，并加入2 mmol·L-1N-乙酰半胱氨酸（NAC）[32]。以不加NAC的0.9%NaCl為對照，30℃條件下培養1 h后，向加入NAC的培養瓶中依次加入0、10、20、50、100、200 mg·L-1的BM，培養2.5 h后，測定各體系的致死率和ROS含量，并在LSCM和SEM下直觀觀察細胞的損傷情況。

1.7 數據分析

采用Origin 2018進行數據處理及作圖，數據表示為平均值±標準差，ROS和存活率的測定均設置3次平行，采用SPSS對數據進行方差分析（One way ANO?VA）及Turkey′s Test分析，P＜0.05表示有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 BM和BC的性質

BM和BC的基本性質見表1。分析表1可知，BM的比表面積遠大于BC，是BC的3.15倍，而pH值低于BC。由表1中的元素分析結果可知，BM中C和O的含量高于BC，這與BM溶液比BC溶液的顏色黑這一實驗現象相吻合。將BM和BC置于蒸餾水中，超聲30 min后，BC在10 min內上浮或者沉淀，而BM在12 h內未發生沉淀，說明BM的穩定性和分散性優于BC。

表1 BM和BC的比表面積、pH和元素組成Table 1 Specific surface area，pH and elemental composition of BM and BC

用掃描電子顯微鏡對BM和BC的顆粒大小和形態進行比較的結果見圖1。由圖1a和圖1b可知BC是多孔的，存在明顯的孔狀結構，粒度為毫米級別，孔徑約為1 μm。由圖1c和圖1d可知，BM的粒徑不規則，且大小不均勻，但都在1 μm以下，圖中圈出的紅色部分為小于100 nm的顆粒。總體來看，BM的粒度在60 nm～1 μm之間。BC經過球磨成BM后，顆粒粒徑減小，顆粒數量大量增加，這導致了比表面積的增加，與比表面積的結果一致。

圖1 BM和BC的掃描電鏡圖Figure 1 Scanning electron microscopy（SEM）of BM and BC

從BM和BC的紅外圖譜（圖2）可以發現，BM在3356 cm-1和3048 cm-1處，O-H和N-H鍵顯著拉伸，C=C、N=N、C=N和N=O雙鍵在1586 cm-1處伸縮振動，C-H在873、810 cm-1和749 cm-1處彎曲振動。此外，在BM上觀察到兩個新的峰，分別為1380 cm-1和1092 cm-1處的酚醛C-X和C-O，表明球磨引入了一些酸性官能團，這與pH值的結果相一致。在測試條件下，BM表面酸性官能團的引入會增強電雙層之間的排斥力，以防止亞微米球磨生物炭粒子的聚集，這與超聲分散的結果一致。

圖2 BM和BC的紅外圖譜Figure 2 Fourier transform infrared（FTIR）of BM and BC

2.2 添加BM和BC對E.coli和S.aureus存活率的影響

經過2.5 h的毒性暴露實驗后，E.coli和S.aureus的存活率測定結果如圖3所示。在0.9%NaCl中，僅添加10 mg·L-1的BM，S.aureus的存活率為90.1%，當濃度增大到200 mg·L-1時，存活率僅為23.5%；而添加10 mg·L-1的BC時，S.aureus的存活率為98.2%，當濃度增大到200 mg·L-1時，存活率仍為68.9%。這說明相比于BC，BM對S.aureus的毒性更顯著。在LB培養基中，BM濃度為200 mg·L-1時，S.aureus存活率為60.9%，這說明在LB培養基中，BM對S.aureus的毒性減弱。無論是在0.9%NaCl還是LB培養基中，添加BM和BC后，E.coli的存活率一直維持在90%以上，且兩者差別較小，這說明BM和BC對E.coli的存活率影響不顯著。由SPSS分析，數據對照均具有顯著性差異。

2.3 添加BM和BC對E.coli和S.aureus氧化損傷的影響

為了分析BM和BC對E.coli和S.aureus產生毒性的原因，測定了兩種菌細胞內的ROS含量，結果如圖4所示。細菌和培養介質相同的條件下，添加BM產生的ROS是BC的1.1～2.0倍。如圖4a所示，在0.9%NaCl中，添加BM對E.coli最大的氧化損傷為空白的1.4倍，對S.aureus的氧化損傷最大為空白的6.4倍，且倍數隨著BM濃度的增加而增加，說明BM對S.aureus造成的氧化損傷遠大于E.coli。如圖4b所示，在LB培養基中，添加BM對E.coli最大的氧化損傷為空白的1.2倍，對S.aureus的氧化損傷為空白的4倍。對比圖4a和圖4b可以發現，在LB培養基中，添加BM和BC后，細菌細胞內的ROS均有所減少。

圖3 0.9%NaCl和LB培養基中細菌的存活率Figure 3 Livability of bacteria in 0.9%NaCl and LB medium

圖4 0.9%NaCl和LB培養基中細菌產生的ROSFigure 4 ROS produced by bacteria in 0.9%NaCl and LB medium

2.4 BM對S.aureus產生毒性的機理探究

2.4.1 NAC對S.aureus產生ROS與存活率的影響

由于BM對E.coli的毒性效果不明顯，因此以S.aureus為模式菌株探究BM毒性與氧化損傷的關系。

如圖5所示，加入NAC后，各處理組ROS的含量降低至與空白相接近，說明各組中ROS的作用已基本消除。與暴露于BM的各組相比，加入的NAC使得S.aureus存活率升高，但是與對照相比仍有一定差距。說明BM對S.aureus產生毒性主要是由于氧化損傷導致的，但是其他因素，例如BM的機械碰撞作用也有可能是造成毒性的一個原因，因此雖然消除了ROS，但其存活率與對照相比仍有一定差距。

2.4.2 E.coli和S.aureus的LSCM圖像

為進一步證實上述推測，采用熒光活/死染色法觀察細菌膜完整性，區分活菌（綠色）和死菌（紅色），以探討BM和BC對E.coli和S.aureus的抗菌能力。選取在0.9%NaCl中，添加BM后的E.coli和S.aureus的LSCM圖像進行分析。如圖6所示，在0.9%NaCl中，不添加BM時，E.coli和S.aureus幾乎全為綠色，添加BM后，E.coli和S.aureus中均有紅色出現，且紅色部分所占比率和BM的濃度呈正相關。同一濃度下，S.aureus中紅色部分遠大于E.coli，說明BM對S.aureus的毒性遠大于E.coli。在0.9%NaCl中添加200 mg·L-1BM，消除ROS后S.aureus的LSCM圖像（圖6d）與未消除ROS的圖像（圖6c）相比，紅色部分大量減少，說明加入NAC后，S.aureus的存活率上升。

2.4.3 E.coli和S.aureus的SEM圖像

為了進一步確定實驗結論，采用SEM觀察了E.coli和S.aureus的表面形態。選取在0.9%NaCl中，添加BM后E.coli和S.aureus的SEM圖像進行分析，如圖7所示：不添加BM的S.aureus表面光滑，無褶皺存在。添加BM后，S.aureus的表面存在褶皺，且隨著BM濃度的增加，褶皺更加明顯。可能是由于BM造成S.aureus細胞膜和細胞壁損傷，細胞質泄漏所致；不添加BM的E.coli表面光滑無破損，添加BM后，細胞表面存在微量的褶皺，但是隨著濃度增加，細胞體積不變。說明在0.9%NaCl中，BM對S.aureus的毒性遠大于E.coli。在LB培養基中也有相似情況，但沒有在0.9%NaCl中明顯。在0.9%NaCl中添加200 mg·L-1BM，消除ROS后S.aureus的SEM圖像（圖7d）與未消除ROS的圖像（7c）相比，褶皺大量減少，細胞膜基本無褶皺。這與ROS、存活率和LSCM的結果吻合。

圖5 0.9%NaCl中S.aureus產生的ROS與S.aureus的存活率Figure5 ROS produced by S.aureus and livability of S.aureus in 0.9%NaCl

圖6 在0.9%NaCl中添加BM后細菌的LSCM圖像（×40倍）Figure 6 LSCM image of bacteria in 0.9%NaCl after adding BM（×40 times）

加入NAC消除ROS的實驗說明氧化損傷是造成細胞死亡的重要原因，但是其他因素，例如納米顆粒對細胞的機械碰撞等也有可能是造成BM毒性的原因。

3 討論

本次研究的實驗結果表明，相比于BC，BM具有更低的pH值，更多的酸性官能團，更大的比表面積，這與Lyu等[14]和Wang等[33]的研究結果一致。球磨能夠將毫米尺度的顆粒減小到納米級別，由于顆粒減小，BM在蒸餾水中分散得更好。同時，也由于顆粒減小使大量亞微米顆粒增加，從而導致了BM比表面積的增加。FTIR結果表明，BM具有更多的酸性官能團，從而導致pH值的降低。

對比BC和BM，相同條件下，BM的毒性更明顯。BM由BC經過球磨得到，通過球磨，可能會增加持久性自由基的數量[34-35]。本次研究中，相比于LB培養基，BM在0.9%NaCl中對S.aureus的毒性更明顯，可能是由于LB培養基中的營養物質起到了緩沖與保護作用，這與Liu等[24]的研究結果一致。在兩種介質中，BM的毒性都大于BC。這除了與自由基有關，可能還與顆粒尺寸有關。由圖1可知，BM的粒度在60 nm～1 μm之間，遠小于BC[36]，而S.aureus的直徑在0.8 μm左右，小于100 nm的顆粒極有可能穿過細胞的細胞膜，進入細胞，造成高濃度的ROS，從而導致S.aureus的死亡。100 nm～1 μm之間的顆粒，由于培養過程中的振蕩作用，會對S.aureus產生撞擊，從而造成一定的機械損傷。由于粒度減小，導致BM具有更大的比表面積[33，37]，與 E.coli和 S.aureus的接觸更充分，使其產生更高濃度的ROS，所以損傷更大。此外，BM對E.coli和S.aureus的毒性效應不同，可能還與E.coli產生的胞外聚合物（EPS）有關。由于革蘭氏陽性菌與陰性菌的細胞壁構造不同，在其表面產生的EPS也不同[38]。EPS不僅可以起到屏障作用，防止生物炭所造成的物理損傷，而且還可以作為ROS的匯，保護細菌免受生物炭的毒害[39]。

圖7 在0.9%NaCl中添加BM后細菌的SEM圖像（×40 000倍）Figure 7 SEM image of bacteria in 0.9%NaCl after adding BM（×40 000 times）

4 結論

（1）球磨生物炭具有更多的酸性官能團和更大的比表面積。

（2）球磨生物炭對E.coli和S.aureus的毒性影響遠大于生物炭。

（3）球磨生物炭對S.aureus的毒性高于E.coli，且毒性與濃度呈正相關。