鄰苯二甲酸二甲酯對熒光假單胞菌的損傷研究

郭茹鑫，王志剛*，王春龍，由義敏，王恒煦

（1.齊齊哈爾大學生命科學與農林學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.上海交通大學農業與生物學院，上海 200240）

鄰苯二甲酸二甲酯（Dimethyl phthalate，DMP）是一類被廣泛應用的人工合成有機化合物[1]。DMP對生物體具有致畸、致癌、致突變的性質，因此已被美國環保署及中國環境保護局列為優先控制污染物[2]。DMP與聚合物通過非共價鍵結合，因此很容易滲透到環境當中。到目前為止，土壤[3]、大氣[4]、水環境[5]均已檢測出DMP，可見其污染的廣泛性。汕頭蔬菜產區土壤樣品中DMP的含量已超過美國土壤優先控制標準，超標率為38.1%[6]；青島市兩種土壤中DMP的濃度分別為 0.07 mg·L-1和 0.04 mg·L-1[7]；天津大氣 PM10樣品中DMP占總肽酸酯含量的0.72%～6.72%[8]；黃河蘭州斷面[9]水體中DMP最高檢測濃度為6.3×10-2mg·L-1；青島海岸帶表層沉積物中DMP的濃度范圍為1.7×10-3～9.5×10-2mg·L-1[10]。

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）是一類廣泛分布于自然界的革蘭氏陰性菌，可作為植物抗病菌，其產生的揮發性化合物、硝吡咯菌素等抗生素可抵抗病原真菌對植物造成的病害[11-12]；又可作為植物根際促生菌，促進植物更好地吸收營養物質，同時還能產生各種酶和代謝物用以抵抗各種生物和非生物的脅迫[13-14]。

有研究指出DMP污染改變了土壤中微生物的代謝活性和功能多樣性，增加了與氮素代謝有關的某些菌屬的百分比，從而使土壤有益菌屬的百分比降低，對土壤環境產生了不良影響[3，15-17]。DMP污染嚴重抑制了黑土中P.fluorescens的生長[3]，但DMP對細菌細胞的毒理作用尚不清楚。因此，本試驗以DMP與P.fluorescens為研究對象，探討DMP污染對P.fluorescens細胞的損傷機制，為探究DMP生態毒理效應和生物修復技術提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

P.fluorescens ATCC13525由中國普通微生物菌種保藏管理中心提供。

牛肉膏蛋白胨培養基：3 g牛肉膏、10 g蛋白胨、5 g NaCl和1 L雙蒸水，pH 7.0。加入不同量的DMP，使DMP的終濃度分別為0、10、20、40 mg·L-1。

實驗所用主要試劑如表1所示。

表1 試驗試劑Table 1 Test reagents

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌培養

P.fluorescens 30 ℃，130 r·min-1過夜培養，將細菌培養液按1%的接種量分別接種到含有0、10、20、40 mg·L-1DMP的100 mL滅菌牛肉膏蛋白胨培養基中。以不加DMP的處理為對照組（CK），10、20、40 mg·L-1DMP濃度為實驗組。30 °C，130 r·min-1振蕩培養細菌至對數生長中期（8 h），進行試驗。

1.2.2 平板計數試驗

分別取1 mL在不同濃度DMP（0、10、20、40 mg·L-1）條件下培養5 h和8 h的細菌，再分別將其加入裝有9 mL滅菌的去離子水試管中，依次進行濃度稀釋，最終取稀釋度為108和109的菌懸液100 μL進行平板涂布試驗，根據對數生長的數學模型計算細菌比生長速率與代時和DMP污染濃度的相互關系。比生長速率（μ）和代時（G）公式如下：

式中：Nt和N0分別代表時間8 h和5 h時的細胞數量。

1.2.3 細菌表面Zeta電位試驗

取 5 mL在不同濃度 DMP（0、10、20、40 mg·L-1）條件下培養8 h的P.fluorescens，于 4000 r·min-1離心10 min，收集菌體，用滅菌的去離子水清洗并且重懸，制備成終濃度為OD600=0.8的菌懸液。利用Zeta電位儀測定細菌表面電位[18]。

1.2.4 細菌膜流動性試驗

取10 mL在不同濃度DMP（0、10、20、40 mg·L-1）條件下培養8 h的P.fluorescens，于 4000 r·min-1離心10 min，棄上清，用滅菌的去離子水清洗并且重懸，制備成終濃度OD600=0.8的菌懸液。加入新配制的100 μmol·L-1的DPH四氫呋喃溶液5 –L，室溫避光染色細菌30 min，得到DPH標記的細菌。再利用帶有偏振裝置的熒光分光光度計測定熒光偏振度P。檢測條件：激發波長Ex=360 nm；發射波長Ex=427 nm；激發狹縫5 nm；發射狹縫10 nm[19]。

1.2.5 透射電鏡（TEM）試驗

取1.5 mL在不同濃度DMP（0、10、20、40 mg·L-1）條件下培養8 h的P.fluorescens，用滅菌的去離子水清洗并且重懸。取菌懸液100–L于錫箔紙上，自然風干后分別在2.5%戊二醛與1%鋨酸中于4℃下固定4 h，然后用30%、50%、70%、85%和95%的乙醇梯度脫水，再經100%乙醇脫水2次，脫水后凍干。將凍干的樣品經Eponate 812環氧樹脂包埋，超薄切片（70 nm左右）后，經醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染，透射電子顯微鏡觀察菌體表面形態變化[20]。

1.2.6 DMP在P.fluorescens細胞內外的分布

取10 mL在不同濃度DMP（0、10、20、40 mg·L-1）條件下培養8 h的P.fluorescens，4000 r·min-1離心 10 min，收集上清液于干凈的試管中，再加入5 mL滅菌的去離子水洗滌一次，將上清液與試管中的溶液合并，用于測定細胞外DMP濃度；剩余沉淀細菌加5 mL滅菌的去離子水重懸，通過超聲波細胞粉碎機破碎細胞，11 000 r·min-1離心10 min后收集上清液，用以測定細胞內DMP濃度[21]。每個樣品分別用相同體積的乙酸乙酯萃取，取上層有機相于旋轉蒸發儀中蒸干，再用色譜級甲醇定容至10 mL，取1 mL溶液置于液相小瓶中，通過高效液相色譜檢測其中的DMP含量。檢測條件為流動相：90%甲醇，10%水；柱溫：30℃；流速：0.5 mL·min-1；檢測波長228 nm[22]。

1.3 數據處理

所有實驗均進行3次平行處理，實驗數據以平均值±標準差表示，數據采用SigmaPlot 12.5進行圖表繪制，SPSS 22.0軟件進行統計分析，P＜0.05具有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 P.fluorescens比生長速率與代時和污染濃度的關系

對數生長的數學模型在現代微生物學中的應用越來越重要，它能較明確地表達生命現象的動態過程。如圖1A所示，與CK相比，隨著DMP污染濃度增加，比生長速率逐漸減小，說明DMP污染濃度越大，細菌每小時增加的數量越少，即生長速度緩慢。從圖1B可以看出，隨著DMP污染濃度增加，代時（每個細菌分裂繁殖一代所需的時間）越長。此試驗表明隨著DMP污染濃度增加，細菌個體繁殖速度遲緩且生長速率緩慢。這與Wang等[23]研究表明較大的DMP濃度對P.fluorescens的生長和葡萄糖的利用有很大抑制作用的結果一致。

圖1 P.fluorescens在不同濃度DMP處理下的比生長速率（A）及代時（B）Figure 1 The specific growth rate（A）and generation time（B）of P.fluorescens treated with different concentrations of DMP

2.2 P.fluorescens表面Zeta電位變化

細胞壁是細菌的重要結構，同時也是保護細胞免受外界損傷的第一層保障[24]。P.fluorescens表面Zeta電位變化如圖2所示，CK的表面電勢為-12.21±0.56 mV。隨DMP污染濃度增加，細菌表面Zeta電位逐漸減小，最低為-18.13±0.67 mV。細菌含有獨特的細胞壁結構，包括肽鏈和氨基糖鏈組成的肽聚糖及其他蛋白質、多糖類物質，這是細菌表面帶有負電荷的原因。Liu等[18]用低濃度全氟辛烷磺酸和全氟辛酸處理大腸桿菌后細菌表面Zeta電位降低，與本研究結果一致。可能是細菌免疫產生蛋白和脂多糖以減少自身損傷的結果，或由于細胞內電荷的內容物流出，附著在細菌表面，降低細胞表面所帶的負電荷，導致Zeta電位的減小[25]。DMP對P.fluorescens的毒理作用機制，在微觀上首先表現為DMP對細菌細胞壁結構的破壞。

圖2 P.fluorescens表面Zeta電位變化Figure 2 Changes of Zeta potential on the surface of P.fluorescens

2.3 P.fluorescens膜流動性變化

生物細胞膜是細胞與外界環境之間的重要屏障，可維持細胞的基本代謝，保護細胞免受外界干擾，其中流動性是維持細胞膜發揮正常功能的關鍵。疏水性熒光探針DPH已經被廣泛用于細胞膜流動性的研究，DPH熒光偏振度與目標生物膜的流動性密切相關：膜流動性增加會降低熒光偏振度P，反之亦然[26-28]。如圖3所示，經DMP污染后，P.fluorescens細胞膜流動性明顯改變，隨著DMP處理濃度的增加，DPH的熒光偏振度從0.194逐漸降低到0.174，細胞膜流動性顯著增加。膜流動性的增加可能會破壞細菌細胞的結構，導致細胞質壁分離，同時細胞內含物會暴露在外部環境中，這也可能是電負性下降的原因[18]。有報道稱化合物全氟辛烷磺酸、蒎烯和四氫萘也會引起細菌細胞膜流動性增加[29-30]，因此我們猜測P.fluorescens膜流動性的增加可能是因為DMP導致細菌的脂肪酸鏈排列松散，破壞細菌的脂雙層結構，進而影響膜的功能[19]。

圖3 P.fluorescens膜熒光偏振度變化Figure 3 Changes of fluorescence polarization on membrane of P.fluorescens

2.4 TEM電鏡觀察

TEM電鏡觀察結果如圖4所示，可以看出未經DMP污染的P.fluorescens縱切面細胞壁和細胞膜完整；橫切面表面光滑，無明顯變形。而DMP污染后，P.fluorescens縱表面出現明顯的質壁分離、表面褶皺（黑色箭頭）；橫切面凹凸變形明顯（白色箭頭）；同時出現了某些細胞內容物的釋放（白色圓圈）。TEM圖明顯說明了P.fluorescens受到DMP污染后，細胞壁和細胞膜遭到破壞。

圖4 P.fluorescens的TEM圖（×50 000倍）Figure 4 TEM images of P.fluorescens（×50 000 times）

2.5 DMP在P.fluorescens細胞內外分布

趙曉松等[31]發現DMP可以與DNA進行嵌插性的結合，改變DNA的結構。王志剛等[32]研究發現DMP污染會抑制Bacillus subtilis B19、Escherichia coli K12生長，對細菌產生氧化損傷，引起細菌氧化應激。DMP在P.fluorescens細胞內外的分布見圖5。由圖可知，培養基中的DMP濃度隨著DMP添加量的增加而增加。在DMP處理濃度為40 mg·L-1時，培養基中的DMP檢測值達到最大，檢測濃度為30.52±0.88 mg·L-1。從圖中還可以看出，在10、20、40 mg·L-1DMP濃度處理下的P.fluorescens細胞內檢測到的DMP濃度越來越高，從 0.11±0.10 mg·L-1升高到了 6.78±0.25 mg·L-1。這說明當P.fluorescens受到DMP污染時，DMP會破壞細胞壁和細胞膜后進入到細胞內，并且隨著DMP濃度的增加，細胞壁和細胞膜的破壞程度越大，進入細胞內的DMP濃度越高。

圖5 DMP在細胞內外含量Figure 5 DMP content inside and outside the cell

3 結論

（1）DMP污染P.fluorescens，導致細菌細胞膜特性改變，其中膜流動性、通透性增加，同時也導致細胞壁表面電位降低，細胞內容物泄露。

（2）DMP污染導致了P.fluorescens比生長速率減小，代時增加。

（3）DMP可以破壞P.fluorescens的細胞壁和細胞膜后滲透進入細菌內，影響細菌正常生長。