氮負荷升高對苦草（Vallisneria natans）和穗花狐尾藻（Myriophyllum spicatum）生長的影響

李啟升，胡忠軍，李永吉 ，何 虎，韓燕青 ，靳 輝，李寬意 ，6*

（1.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；2.上海海洋大學農業部魚類營養與環境生態研究中心，上海201306；3.上海海洋大學上海水產養殖工程技術研究中心，上海 201306；4.中國科學院南京地理與湖泊研究所湖泊與環境國家重點實驗室，南京 210008；5.岳陽市水產科學研究所，湖南 岳陽 414001；6.中國科學院大學中丹學院，北京 100049）

隨著工農業生產的發展、化學肥料使用量的增加以及人類生活污水的直接排放，河流湖泊等地表水的氮（N）、磷（P）元素污染日益嚴重[1]，過量N、P的輸入也被認為是湖泊富營養化的主要原因[2-4]。控源截污是富營養湖泊能夠實現生態修復的前提條件，大量研究表明削減外源P負荷是控源截污工作的重點[5-6]。然而，對于控N（削減外源N輸入）的必要性一直存在爭議。部分學者認為控N會促進固氮藍藻的生長，其固氮作用會彌補外源N輸入的不足，使湖泊保持富營養狀態[7-9]。而其他學者則認為N限制同樣廣泛存在于湖泊生態系統中，藻類的固氮作用不足以抵消削減的外源N負荷，因此在控源截污工作中，N、P均需要控制[10-13]。目前，在我國的污水處理中，P仍是主要的削減指標，尾水中的N濃度較高。例如，《城鎮污水處理廠污染物排放標準》（GB 18918—2002）的一級A標準中TP達標排放濃度為0.5 mg·L-1，而TN達到15 mg·L-1。高N負荷的尾水排放到湖泊后，可能會導致湖泊水體較高的N濃度以及N∶P的失衡。

作為淺水湖泊的主要初級生產者之一，沉水植物在生態系統中扮演著重要的角色，對于維持湖泊“清水態”具有重要的作用。例如沉水植物可以通過化感作用和營養競爭抑制浮游植物生長[14]，能促進水體懸浮顆粒物沉降，同時抑制沉積物再懸浮[15]。近年來，越來越多的證據表明水體中較高的N濃度是導致淺水湖泊沉水植物衰退的原因之一[16-18]。其機理主要有兩個方面：首先，高N濃度能夠抑制某些沉水植物的生理活性[19-20]。例如，Su等[21]的模擬實驗發現較高的氨氮濃度（＞10 mg·L-1）使水薀草（Egeria densa）葉片的氧化應激和光合作用受到抑制，植物生長受阻；其次，N濃度升高還能夠促進浮游植物或植物表面附著藻類的生長，從而降低沉水植物的光照可得性。例如，章宗涉[22]的研究發現，隨著N等營養鹽的持續輸入，水體中浮游植物迅速增長，水體透明度下降，沉水植物的生長率明顯降低。

苦草（Vallisneria natans）和穗花狐尾藻（Myriophyllum spicatum）是長江中下游流域常見的兩種沉水植物，苦草為蓮座型沉水植物（Rosette producer），葉基生，根系發達；而穗花狐尾藻為冠層型（Canopy pro?ducer），葉輪生[23]。在自然水體中，二者在營養鹽和光照中存在著較強的競爭關系[24-26]。然而，在共存情況下，二者對水體N負荷升高的響應還未見報道。基于此，我們設計了一個室外模擬實驗，通過同株數混栽兩種沉水植物，探討外源N負荷升高（輸入N∶P從5∶1提高到100∶1）對兩種沉水植物生長的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗設置

本實驗于2017年8月21日至9月18日在中國科學院太湖湖泊生態系統研究站的實驗平臺上進行，實驗周期為28 d。預先在太湖梅梁灣打撈足量沉積物，經10目篩網過濾掉螺貝類后放入500 L的聚乙烯桶中，充分混勻后再分裝到每個實驗桶中，每桶沉積物厚度為10 cm。實驗桶為80 L藍色聚乙烯桶（高57 cm、頂部直徑45 cm、底部直徑36 cm）。實驗用水同樣采集自太湖梅梁灣，經64 μm浮游生物網過濾掉浮游甲殼動物后，緩緩注入到每個實驗桶中，保證每個實驗桶內水面距桶頂部10 cm，因此，每個實驗桶約含有57 L太湖水。實驗用沉水植物提前半個月在太湖周邊河道中采集，種植在有沉積物和湖水的塑料箱中培養。實驗開始時，從塑料箱中挑選植株健康、長勢良好、株高和生物量一致的苦草和穗花狐尾藻幼苗，采用同心圓的方式在每個聚乙烯桶內間隔種植，每個桶中兩種植物各種植10株。苦草和穗花狐尾藻株高均是15 cm，每個桶中苦草初始的平均總濕質量為20.30 g，平均密度為184.55 g·m-2，穗花狐尾藻初始的平均總濕質量為17.47 g，平均密度為158.82 g·m-2。每個聚乙烯桶中初始沉水植物的總密度為343.37 g·m-2。靜置5 d待水體澄清后開始實驗，開始前測得桶內水體的初始總氮（TN）濃度為（3.41±0.38）mg·L-1，總磷（TP）濃度為（0.180±0.015）mg·L-1，葉綠素a（Chla）濃度為（169.6±30.2）μg·L-1，主要藻類為銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）（中國科學院太湖湖泊生態系統研究站監測數據）。

本實驗為單因素實驗，N濃度為唯一變量，設兩個水平，每個水平設4個重復，共8個實驗桶。其中低N組的N負荷設置為25 μg·L-1·d-1，高N組的N負荷設置為500 μg·L-1·d-1，兩個實驗組的P負荷與太湖日均P負荷相同，均為5 μg·L-1·d-1[27]。因此低N組和高N組的N∶P負荷輸入比分別為5∶1和100∶1，該比值在長江中下游湖泊的TN∶TP范圍內（何虎等，未發表數據）。按照實驗設計調配好營養鹽后（氮源為KNO3，磷源為KH2PO4），每日早上8：00左右利用移液槍添加。實驗期間不定期向桶內補充蒸餾水以保證水位恒定。

1.2 測定指標

實驗期間，每7 d采集一次水樣，采樣時間為上午8：00—9：00。采樣時，用柱狀有機玻璃管（直徑為10 cm，高度100 cm）采集混合水樣，實驗室內測定水體TN、TP、硝氮（NO-3-N）、氨氮（NH+4-N）、正磷酸鹽（PO3-4-P）和Chl-a濃度，測量方法依據《湖泊富營養化調查規范》[28]。

實驗結束時（第28 d），小心采集各桶內所有的苦草和穗花狐尾藻植株。在實驗場地內清洗干凈，立即帶回實驗室用濾紙吸干植物表面的水分，隨后測定兩種植物的株數和濕質量，并計算生物量（濕質量/面積）和相對生長率（Relative growth rate，RGR）。相對生長率計算公式為：

式中：Wi和Wf分別為植物實驗前和實驗后的濕質量，g；D為時間，d[29]。

此外，我們從每個桶中隨機選取苦草和穗花狐尾藻各5株，測量苦草的葉片數、根長、匍匐莖長以及穗花狐尾藻的節間距、株高等一系列形態指標，最后以5株植物的平均值代表該實驗桶內植物的形態數據。

營養鹽數據用重復測量方差分析（rANOVA）進行比較，兩種沉水植物的生長指標采用獨立樣本T檢驗進行比較。統計分析前利用Shapiro-Wilk檢驗各組數據是否服從正態分布，如果數據不滿足正態分布，則對數據進行lgX轉換，如果轉換后仍不滿足正態分布，則進行非參數的Mann-Whitney U檢驗。所有統計分析均使用SPSS 19.0完成。

2 結果與分析

2.1 營養鹽指標

N負荷升高顯著提高了水體TN和NO-3-N濃度（圖1、表1）。實驗結束時，高N組平均TN、NH+4-N、NO-3-N濃度分別是低N組的334%，102%和494%。

N負荷升高同樣對水體TP濃度和TN∶TP具有顯著的影響，表現為高N組TP和TN∶TP顯著高于低N組（圖1、表1）。實驗結束時，高N組平均TP濃度和TN∶TP是低N組的261%和136%。N負荷升高對水體PO3-4-P濃度的影響不顯著（圖1、表1）。

N負荷升高顯著提高了水體Chl-a濃度（圖2、表1）。實驗結束時，高N組的Chl-a濃度是低N組的619%。

表1 營養鹽的重復測量方差分析Table 1 Repeated measurement analysis of variance of nutrients

2.2 苦草指標

N負荷升高顯著影響了苦草的生物量、相對生長率、葉片數、根長、匍匐莖長和株數（圖3、表2、表3）。低N組苦草的生物量、葉片數、根長和株數分別是高N組的2.35、2.07、1.62倍和2.55倍，低N組苦草的相對生長率（8.28 mg·g-1·d-1）顯著高于高N組（-23.27 mg·g-1·d-1），低N組苦草的匍匐莖長（4.64 cm）同樣顯著高于高N組（無匍匐莖）（P＜0.05）。

圖1 低N組和高N組TN、NO-3-N、NH+4-N、TP、PO34--P濃度和TN∶TP的變化Figure 1 Difference of total nitrogen（TN），nitrate nitrogen（NO-3-N），ammonia nitrogen（NH+4-N），total phosphorus（TP），orthophosphate（PO34--P）content and the ratio of TN and TP between low nitrogen group and high nitrogen group

2.3 狐尾藻指標

N負荷升高對穗花狐尾藻的生物量、相對生長率、節間距、株高和株數的影響均不顯著（圖4、表2）。

2.4 總生物量

N負荷升高顯著影響了兩種沉水植物的總生物量（圖5、表2）。低N組沉水植物的總生物量（321.98 g·m-2）是高N組（115.86 g·m-2）的2.78倍。

3 討論

本研究通過室外模擬實驗，探討混栽條件下兩種沉水植物（苦草和穗花狐尾藻）對N負荷升高的響應。結果表明在28 d的實驗時間內，較高的N負荷對苦草生長產生了明顯脅迫作用（圖3），但是對穗花狐尾藻生長沒有明顯的影響（圖4）。

圖2 低N組和高N組水體Chl-a含量的變化Figure 2 Differences of Chl-a content in water between low nitrogen group and high nitrogen group

表2 低N組和高N組的兩種沉水植物生長和形態指標的獨立樣本T檢驗分析結果Table 2 Independent sample T-test results of growth and morphological indicators of two submerged macrophytes in low-nitrogen group and high-nitrogen groups

圖3 兩個處理組苦草的生物量、相對生長率、根長、匍匐莖長、株數和葉片數的變化Figure 3 Differences of biomass，relative growth rate，root length，stolon length，number of plants and number of leaves of V.natans between both treatments

以往的研究表明，較高的N濃度能夠從生理上直接抑制苦草的生長[30]。例如，Cao等[31]的圍隔實驗發現，苦草根狀莖中游離氨基酸濃度隨著水體NH+4-N濃度的增加而逐漸上升，同時可溶性糖濃度降低，導致繁殖能力下降。潘琦等[32]發現隨著NO-3-N濃度在一定程度上增加，苦草的超氧化物歧化酶、丙二醛活性會升高，但是當NO-3-N濃度繼續升高到40 mg·L-1時，苦草的抗氧化酶系統反而會受損，導致生長受阻。在本實驗中，高N組的TN和NO-3-N濃度均遠高于低N組，較高的N濃度可能對苦草產生了生理上的抑制作用。另外，N負荷升高也可能通過刺激浮游植物生長，從而間接抑制苦草的生長[33]。Yu等[34]的原位實驗發現，隨著水體TN濃度的上升，浮游植物Chl-a濃度也升高，同時水體光照下降，苦草的生物量、葉長和根長明顯降低。Kang等[35]的模擬實驗發現水體Chl-a濃度超過109 μg·L-1時，苦草的可溶性蛋白降低，丙二醛含量升高。黎慧娟等[33]發現浮游植物可以通過產生化感物質來抑制苦草葉綠素的合成或分解其葉綠素從而抑制其生長。在本實驗中，水體Chl-a濃度隨著N負荷升高而明顯上升，實驗結束時高N組平均Chl-a濃度達到了400 μg·L-1，浮游植物對苦草較強的遮光和化感效應也可能抑制了高N組苦草的生長。值得注意的是，本研究中高N組的TP濃度同樣顯著高于低N組（圖1、表1），這可能是富營養水體中N負荷升高引發了生態系統的一個負反饋過程。即：高N負荷抑制了沉水植物的生長，沉水植物的衰退反之又促進沉積物中P的釋放，水體P濃度增加又進一步促進浮游植物的生長以及沉積物P的釋放。He等[36]的模擬實驗同樣發現高濃度N輸入促進了沉積物的P釋放，從而提高了水體TP濃度。

圖4 兩個處理組穗花狐尾藻的生物量、相對生長率、節間距、株高和株數的變化Figure 4 Differences of biomass，relative growth rate，internode length，plant height and number of plants of Myriophyllum spicatum between both treatments

圖5 兩個處理組沉水植物總生物量的變化Figure 5 Difference of total biomass of submerged macrophytes between both treatments

表3 低N組和高N組苦草根長、匍匐莖長和株數的Mann-Whitney U檢驗結果Table 3 Mann-Whitney U test results of root length，stem length and number of plants in low nitrogen group and high nitrogen groups

本研究中，高N組苦草的根長顯著低于低N組，且未長出匍匐莖及分枝，同時苦草葉片數也明顯少于低N組（圖3）。這表明N濃度升高對苦草地上和地下部分的生長均具有不利的影響，同時限制了苦草的繁殖以及種群擴張能力，這和Yu等[34]的原位實驗結果較為相似。類似地，張雪等[37]的模擬實驗也發現隨著水體N負荷升高（從0～160 mg·m-2·d-1），刺苦草（V.spinulosa）根長明顯下降，無性系分株呈下降趨勢。

本研究中，兩個處理組穗花狐尾藻的各項生長和形態指標均無顯著差異（表2），表明N負荷升高對穗花狐尾藻的影響不顯著。以往的研究表明，穗花狐尾藻對N具有較高的耐受性。例如，王愛麗等[38]的研究發現當水體NH+4-N濃度超過3.5 mg·L-1時，NH+4-N對穗花狐尾藻具有明顯的毒害作用，表現為體內Chl-a和可溶性蛋白含量下降，脯氨酸含量上升。本研究中，高N組的平均NH+4-N濃度為0.29 mg·L-1，該濃度可能不足以對穗花狐尾藻產生生理上的抑制。此外，低N組中苦草對穗花狐尾藻的競爭作用也可能抑制了穗花狐尾藻種群的發展，從而導致高N組和低N組之間穗花狐尾藻的差異不顯著。類似地，閔奮力等[25]的模擬實驗發現穗花狐尾藻與苦草共培養時，分枝數明顯減少。從沉水植物總生物量看，由于苦草生物量的降低，高N組沉水植物的總生物量明顯低于低N組（圖5、表2），同時N濃度升高還明顯促進了浮游植物生長（圖2、表1），表明N負荷升高加速了生態系統的草-藻轉換。

在湖泊的控源截污工作中，控P的必要性已經得到了廣泛認可，但對于控N仍存在較大爭議[5-13]。本研究結果表明N濃度升高會抑制沉水植物的生長，進而加快湖泊富營養化的進程。因此，從湖泊管理和生態修復工作角度，本研究支持N和P均需要控制的觀點。

4 結論

（1）N負荷升高對沉水植物的影響具有種間差異，較高的N濃度對苦草生長產生了明顯的脅迫作用，苦草的各項生長指標均顯著降低。但是N負荷升高對穗花狐尾藻的生長影響不顯著，表明穗花狐尾藻對于高N濃度具有較高的耐受能力。

（2）N負荷升高顯著降低了沉水植物的總生物量，同時增加了水體Chl-a濃度，表明N負荷升高可能會有利于生態系統從草型清水態向藻型濁水態轉化。從湖泊管理和生態修復的角度而言，本研究支持N和P均需要控制的觀點。