俄羅斯鱘補體C7基因的克隆及表達分析

孫夢潔 陳亞東 高 杰 江炎亮 張 雪 佘定懿 許式見 胡 謀趙愛云 沙珍霞,

(1. 青島大學生命科學學院, 青島 266071; 2. 青島海洋科學與技術國家實驗室海洋漁業(yè)科學與食物產出過程功能實驗室, 青島266235; 3. 中國水產科學研究院黃海水產研究所農業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室, 青島 266071; 4. 中國水產科學研究院農業(yè)農村部水生動物基因組學重點實驗室, 北京 100141; 5. 杭州千島湖鱘龍科技股份有限公司, 杭州 311700)

補體系統(tǒng)是迄今所知生物體內最復雜的一個限制性蛋白水解系統(tǒng), 在先天性免疫中起重要作用,在獲得性免疫被激活之前能抵抗細菌和病毒的入侵[1]。魚類補體通過經(jīng)典途徑、替代途徑、凝集素途徑激活, 形成環(huán)狀成孔的膜攻擊復合物(Membrane attack complex, MAC)[2], 其抵抗細菌的免疫保護取決于MAC的殺菌活性。MAC由C5b、C6、C7、C8和C9聚集形成, 首先, C5可以分解為小片段的C5a和C5b, C5a是一種重要的炎癥介質, 不溶于液相, 而C5b和C6在激活細胞附近通過亞穩(wěn)結合位點, 形成穩(wěn)定的C5b-6二聚體[3]。然后, C5b-6自發(fā)地與C7結合形成C5b-7三聚體, 從而使中間產物暴露出膜結合位點, 并產生一個短暫的高親和性脂結合位點, 該結合位點可以非特異性地與周圍的靶細胞結合并插入到其細胞膜中。結合到膜上的C5b-7可以與C8結合, 最終與C9結合形成跨膜復合體。其中, C7是形成MAC的關鍵, 在細胞裂解、宿主防御、促進炎癥中起主要作用。

俄羅斯鱘(Acipenser gueldenstaedti), 隸屬于硬骨魚綱(Osteichthyes), 輻鰭亞綱(Actinopterygii), 軟骨硬鱗總目(Chondrostei), 鱘形目(Acipenseriformes), 是生存至今的古老種群之一, 也是個體最大、壽命最長的淡水魚[4]。其魚子醬具有較高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值, 俗稱“黑黃金”。然而, 在養(yǎng)殖過程中頻繁發(fā)生的病害問題對俄羅斯鱘養(yǎng)殖業(yè)造成了一定的經(jīng)濟損失[5]。其中, 俄羅斯鱘病害尤以敗血癥為甚, 危害較大的細菌性病原主要是嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)等。

隨著漁業(yè)生產越來越強調綠色、生態(tài)、可持續(xù)的發(fā)展道路, 免疫增強劑等在水產養(yǎng)殖中得到越來越多的應用。其中殼寡糖具有分子量小、生物相容性好、生物降解性好等優(yōu)點, 并且具有廣譜抗菌活性, 可以提高機體免疫力, 對腸道菌群分布也有重要影響[6,7], 特別適合作為水產動物的飼料添加劑, 以預防和控制疾病。在基礎飼料中添加適量的殼寡糖可以顯著提高吉富羅非魚幼魚(Oreochromis niloticus)[8]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)[9]、虹鱒幼魚(Oncorhynchus mykiss)[10]、錦鯉(Cyprinus carpio koi)[11]等免疫調節(jié)能力。鑒于俄羅斯鱘補體C7基因的研究未見相關報道, 本實驗擬對俄羅斯鱘補體C7基因(AgC7)進行克隆鑒定, 分析其在健康組織、殼寡糖刺激后的組織及細菌感染的免疫組織中的表達變化, 揭示AgC7基因與俄羅斯鱘免疫的相關性, 為俄羅斯鱘健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚、殼寡糖飼料和病原菌

健康俄羅斯鱘[體重(450.0±10.0) g, 體長(47.5±2.5) cm, 魚齡12個月左右]由浙江杭州千島湖鱘龍科技股份有限公司衢州鱘龍水產食品科技開發(fā)有限公司提供; 殼寡糖為衢州鱘龍水產食品科技開發(fā)有限公司惠贈(購自青島市諾瑪科生物技術有限公司); 基礎飼料由天邦食品股份有限公司寧波分公司提供; 實驗所用的嗜水氣單胞菌為本實驗室從俄羅斯鱘病魚個體中分離獲得, 并根據(jù)其形態(tài)特征、生理生化特性及16S rRNA基因序列進行了鑒定。

1.2 飼喂實驗

俄羅斯鱘在戶外帶有遮陽棚的水泥養(yǎng)殖池(直徑4.0 m, 深度1.8 m, 水深0.8 m)中進行流水養(yǎng)殖, 養(yǎng)殖用水引自烏溪江, 水溫保持(22±3)℃。實驗開始前用基礎飼料飼喂俄羅斯鱘10d, 以消除環(huán)境脅迫,殼寡糖飼料飼喂組(以下均簡稱為實驗組)和普通飼料飼喂組(以下均簡稱為對照組)各設3個平行組, 每組100條魚, 按照3.00%質量比添加殼寡糖制備含糖飼料, 用于實驗組俄羅斯鱘的飼喂; 對照組采用基礎飼料進行飼喂[12], 每組飼喂時間均為60d, 每天按照俄羅斯鱘體重的5.00%投喂飼料2次, 同時進行常規(guī)的殘餌和糞便清理以保證水體清潔。

1.3 感染實驗

在嗜水氣單胞菌感染實驗中, 實驗組用半致死劑量的菌液(半致死劑量3.18×105CFU/g)對健康俄羅斯鱘進行腹腔注射, 對照組用同體積的PBS (300 μL/200 g)腹腔注射健康俄羅斯鱘, 每組設置3個重復,每個重復隨機選取72個鱘魚個體[13]。

1.4 樣品的采集與保存

在組織取樣前, 將所有組的俄羅斯鱘饑餓處理24h, 然后解剖分離組織。分別隨機選取實驗組和對照組的各3尾俄羅斯鱘分離血液、腦、鰓、性腺、心臟、頭腎、腸、肝、肌肉、皮膚、脾、胃和后腎組織; 在嗜水氣單胞菌感染實驗中, 腹腔注射0、6h、12h、24h、48h、72h和96h后分別隨機選取3尾俄羅斯鱘分離血液、鰓、頭腎、腸、肝和脾組織。將所有收集的組織立即放入液氮中, 然后轉移至-80℃冰箱中長期保存, 以備RNA提取。

1.5 總RNA提取及cDNA合成

根據(jù)動物組織總RNA提取試劑盒(天根, 北京)的說明書, 從保存于-80℃的各種組織中提取總RNA。然后用Agilent 2100 biological analyzer (Applied Biosystems, 美國)檢測其質量和濃度, 瓊脂糖凝膠電泳(1.00%)檢測提取的RNA的完整性。最后,用DNaseⅠ酶于37℃下消化30min以去除殘留的DNA[14]。用Prime ScriptTMRT reagent Kit (寶生物,大連)合成cDNA第一條鏈, 合成的cDNA放置在-20℃冰箱。

1.6 AgC7基因cDNA全長克隆

根據(jù)從俄羅斯鱘性腺轉錄組數(shù)據(jù)庫中獲得的AgC7基因部分序列[15], 用Primer 5設計特異性引物(表 1), 通過普通PCR和RACE (Rapid-amplification of cDNA ends)克隆擴增AgC7基因的全長cDNA序列。首先, 通過普通PCR反應獲得AgC7基因的部分序列, 反應體系: 1.0 μL cDNA模板(100 ng/μL)、1.0 μL上游引物(10 μmol/L)、1.0 μL下游引物(10 μmol/L)、4.0 μL dNTP Mix、5.0 μL 10×RTaqBuffer、0.5 μL RTaq和37.5 μL ddH2O; 擴增程序設定為: 95℃7min預變性; 95℃ 30s, 60℃ 30s, 72℃ 3min, 35個循環(huán); 72℃延伸5min。PCR產物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分析、切膠回收純化后, 連接到Trans-T1載體(全式金, 北京)并轉化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞,挑選陽性克隆進行測序, 驗證AgC7基因的部分序列[16]。然后采用Clontech SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒(Clontech)進行3′RACE和5′RACE擴增以獲得AgC7基因的完整cDNA序列。反應體系: 1.0 μL cDNA模板(100 ng/μL)、1.0 μL上游引物(10 μmol/L)、1.0 μL下游引物(10 μmol/L)、3.5 μL PCR MasterMix (含染料)和13.5 μL ddH2O;擴增程序設定為: 95℃ 5min預變性; 94℃ 30s, 55℃30s, 72℃ 60s, 35個循環(huán); 72℃延伸7min。

表 1 俄羅斯鱘補體C7基因克隆和表達分析所用引物Tab. 1 PCR primers used for cloning of C7

1.7 AgC7基因的序列分析

將測序得到的AgC7基因的cDNA序列信息提交到NCBI網(wǎng)站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi), 通過BLAST程序對其進行核苷酸同源性比對。通過NCBI ORF Finder (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html), 分析cDNA序列的開放閱讀框(ORF)。使用ExPasy website (http://www.expasy.org)預測氨基酸序列, 用Protparam (http://www.expasy.org/tools/protparam.html)預測其相對分子質量和等電點。通過DNAMAN對AgC7與GenBank上下載的其他物種的C7進行多重序列比對, 利用MEGA 5.1軟件中相鄰連接法(Neighbor-Joining method)構建系統(tǒng)進化樹。用SignalP 4.0 Server進行蛋白質信號肽預測, 在SMART online tool (http://smart.emblheidelberg.de)中預測蛋白的結構域。

1.8 AgC7基因的表達分析

使用ABI PRISM 7500HT熒光定量PCR儀(Applied Biosystems, 美國), 采用SYBR?Premix ExTaq?(寶生物, 大連)進行AgC7的qRT-PCR檢測, 研究AgC7基因在俄羅斯鱘健康組織、殼寡糖刺激后的組織及病原刺激后的免疫組織中的表達水平。用FastKing RT Kit試劑盒(With gDNase) (寶生物, 大連)合成cDNA第一條鏈, 稀釋10倍作為qRT-PCR擴增反應的模板, 以俄羅斯鱘18S rRNA為內參, 每個樣品設置3個重復, 反應體系如下: 0.6 μL上游引物(10 μmol/L)、0.6 μL下游引物(10 μmol/L)、10.0 μL 2×Realtime PCR Super mix、1.0 μL cDNA sample(100 ng/μL)和7.8 μL ddH2O[17]。反應程序為: 95℃預變性8min; 95℃變性10s, 60℃退火20s, 72℃延伸35s, 40個循環(huán); 72℃延伸7min。實驗中使用的引物如表 1。

1.9 數(shù)據(jù)分析

qRT-PCR實驗數(shù)據(jù)經(jīng)7500 software v2.0.6.處理后, 以平均值±標準差(Mean± SD)表示, 使用2-ΔΔCt法計算相對表達量。用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行處理, 采用單因子方差分析(One-Way ANOVA), Duncan多重比較組間的差異性, 以P＜0.05為顯著性差異。最后, 用Origin 9軟件對相對定量表達做直方圖。

2 結果

2.1 AgC7基因的cDNA全長克隆

將克隆獲得的AgC7基因cDNA的5′-UTR和3′-UTR進行序列拼接并通過BLAST分析后確定為補體C7。AgC7基因的cDNA全長為3103 bp (GenBank登錄號: MH973660), 5′-UTR為44 bp, 3′-UTR為554 bp,開放閱讀框(Open Read Frame, ORF)為2502 bp, 編碼833個氨基酸殘基, 加尾信號在PolyA上游20位核苷酸處。

2.2 AgC7基因編碼蛋白的生物信息學分析

推導的AgC7蛋白相對分子質量約為92.3 kD,等電點為6.24, GC含量為45.64%。AgC7蛋白存在16個氨基酸殘基(Amino acid, aa)的信號肽序列(3—18 aa), 其中包括8個蛋白結構域、2個TSP1結構域(32—82和492—540 aa)、1個LDLa結構域(86—123 aa)、2個FIMAC結構域(687—755和760—832 aa)、1個MACPF結構域(237—439 aa)和2個CCP結構域(560—615和620—677 aa, 圖 1)。

AgC7蛋白與其他魚類的補體C7有廣泛的同源性, 其中與斑點雀鱔(Lepisosteus oculatus, XP0066 26977.1)、斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus, XP01732 2364.1)、斑馬魚(Danio rerio, XP005161294.1)、大西洋鮭(Salmo salar, NP001133245.1)、尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus, XP005470513.1)等魚的氨基酸序列一致性分別為56%、46%、49%、49%和47%。將俄羅斯鱘補體C7與這5種魚類補體C7的氨基酸序列進行多重比對, 可以看出, 魚類補體C7存在一些高度保守的氨基酸殘基, 尤其是Cys殘基, 其分子間形成的二硫鍵在蛋白折疊和功能驅使中起重要作用[18]。

圖 1 補體C7的預測結構域Fig. 1 Domain structure prediction of complement C7

從NCBI blast的比對結果中選取來源于其他物種補體C7的氨基酸序列, 包括哺乳類人(Homo sapiens, J03507.1)、蘇門答臘猩猩(Pongo abelii, NM 001132284.1)、家鼠(Mus musculus, NM0012438 37.1); 兩棲類非洲爪蟾(Xenopus laevis, NM00109 1647.1); 爬行類揚子鱷(Alligator sinensis, XP006 033524.1); 魚類斑點雀鱔(L. oculatus, XP006626 977.1)、(Miiuy croaker, KP689602.1)、鰱(Hypophthalmichthys molitrix, JN806258.1)、褐牙鲆(Paralichthys olivaceus, AB020964.1)、虹鱒(O. mykiss,NM001124618.1)、草魚(Ctenopharyngodon idella,JN655169.1)、斑馬魚(D. rerio, XP005161294.1)、尼羅羅非魚(O. niloticus, XP005470513.1), 用MEGA 5.1構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖 2)。從圖 2可以看出, 魚類C7聚在一起, 其中AgC7與鰱處于同一分支上, 親緣關系較近, 然后與褐牙鲆、虹鱒、草魚、尼羅羅非魚聚為一類, 而斑點雀鱔和鮸魚聚為另一類, 水生動物的補體C7與哺乳動物親緣關系較遠。

圖 2 俄羅斯鱘補體C7的進化樹分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of Russian sturgeon complement C7

2.3 AgC7基因在健康俄羅斯鱘組織中的表達分析

AgC7基因在檢測的健康俄羅斯鱘血液、腦、鰓、性腺、心臟、頭腎、腸、肝、肌肉、皮膚、脾、胃和后腎共13種組織中均表達。設定表達量最低的肌肉為參考值1.00, 相對表達量最高的組織是腸(211), 其次是腦(90)、血液(72)、頭腎(52)和心臟(41), 在胃(33)、肝(18)、脾(17.1)、鰓(12.5)、性腺(8.1)、皮膚(5.6)及后腎(1.2)中的表達量相對較低,AgC7基因在不同組織中表達存在組織特異性(圖 3)。用添加殼寡糖的飼料飼喂健康俄羅斯鱘60d,AgC7基因的相對表達量如圖 3, 結果顯示實驗組基因的相對表達水平高于對照組, 殼寡糖能夠誘導AgC7基因的上調表達。且AgC7基因在腸中表達上升的趨勢最明顯, 約為對照組的1.51倍。腸道是主要的免疫器官, 補體表達量提高, 可以抵抗微生物感染。

2.4 細菌性病原刺激后AgC7基因在俄羅斯鱘免疫組織中的表達分析

經(jīng)嗜水氣單胞菌感染健康俄羅斯鱘后,AgC7基因在免疫組織中不同時間點的表達水平如圖 4,結果顯示:AgC7基因的表達量迅速上升, 隨著病原菌感染時間增加, 基因表達量逐漸下降并恢復至正常水平。設組織中0的基因表達量為參考值1.00。血液中AgC7基因表達上調, 最大表達量出現(xiàn)在感染后72h, 是對照組的4.23倍; 在鰓中AgC7基因表達的上調趨勢最明顯, 最大表達量出現(xiàn)在感染后6h,為對照組的41.30倍, 12h后基因表達迅速下降并恢復至正常水平; 在頭腎和脾中基因的表達呈現(xiàn)相同的上調趨勢, 其表達峰值出現(xiàn)在嗜水氣單胞菌感染后24h, 在頭腎中為對照組表達量的2.70倍, 在脾中為對照組表達量的6.01倍; 在腸和肝中AgC7基因表達量變化不大, 在腸中最大表達量出現(xiàn)在感染后6h,是對照組的1.58倍, 在肝中最大表達量出現(xiàn)在感染后12h, 是對照組的1.48倍。

圖 3 補體C7基因在俄羅斯鱘健康組織及殼寡糖刺激后的組織中的實時定量表達分析Fig. 3 The gene expressions of AgC7 in all tissues from healthy Russian sturgeon and chitosan oligosaccharide stimulated group血液(Bl)、腦(Br)、鰓(Gi)、性腺(Go)、心臟(He)、頭腎(Hk)、腸(In)、肝臟(Li)、肌肉(Mu)、皮膚(Sk)、脾(Sp)、胃(St)、后腎(Tk)。用SPSS 19.0軟件, 采用單因子方差分析法(One-Way ANOVA)分析數(shù)據(jù)差異性, 圖中“a, b, c”為SPSS軟件中Duncan算法計算出的子集分組。有相同字母表示差異不顯著(P＞0.05), 無相同字母表示差異顯著(P＜0.05)Blood (Bl), brain (Br), gills (Gi), gonad (Go), heart (He), head kidney (Hk), intestine (In), Liver (Li), muscle (Mu), skin (Sk),spleen (Sp), stomach (St), trunk kidney (Tk). Statistical analysis of differences was done by one-way analysis of variance (ANOVA)on SPSS 19.0 software, the letters “a, b, c” are subsets by Duncan algorithm. The same letters indicated that there was no significant difference in groups (P＞0.05), the different letters indicated that there was significant difference in groups (P＜0.05)

3 討論

研究表明, 補體C7與C5b、C6、C8、C9形成膜攻擊復合物, 它們都屬于同一個基因家族, 可能由同一個原始基因經(jīng)過一系列進化形成[19]。免疫系統(tǒng)作為機體生存的必需部分, 可以保護機體免受病原體的侵害。目前, 先天性免疫和獲得性免疫已得到全面研究, 獲得性免疫可以追溯到脊椎動物進化的早期階段[2]; 相比較而言, 先天性免疫是一種古老的防御機制, 并在獲得性免疫激活之前發(fā)揮作用,所以補體系統(tǒng)的重要性是不言而喻的。在哺乳動物之外的物種中很少有關于補體C7的研究, 魚類補體系統(tǒng)的研究始于20世紀80年代, 但有關魚類補體C7的報道還比較少。補體C7基因最早在人類血清中被發(fā)現(xiàn); 在硬骨魚類中,C7基因最早在日本比目魚中得到克隆鑒定[19]。此后, 對虹鱒(O. mykiss)[19]、草魚(C. idellus)[18]、鰱(H. molitrix)[20]和(M. mii-uy)[21]等物種進行了C7基因的克隆和分析, 其他魚類的研究仍然相對較少。2005年Zarkadis等[22]從虹鱒中分離得到C7-1(編碼808個氨基酸)和C7-2(編碼845個氨基酸)2個基因亞型, 并顯示虹鱒C7發(fā)生了基因復制。在硬骨魚類和哺乳動物之間, 補體成分有一些相似的結構單元, 如TSP1、LDLa、MACPF。虹鱒C7-1基因結構中含有2個TSP1和2個CCP, 及LDLRa、MACPF、EGF、FIMAC各1個,虹鱒C7-2除了含有虹鱒C7-1所含有的結構單元外,還多含有一個FIMAC, 而這第2個FIMAC可能與增強C7-2與C5b-6二聚體復合物之間的相互作用有關[22]。C7-1和C7-2則具有相似的結構域, 但進化模式不同, 在健康組織和感染組織中表達模式不同, 但在抵抗病原感染中均發(fā)揮重要作用[21]。本研究對俄羅斯鱘補體C7進行了分子克隆和鑒定, 獲得了其全長cDNA序列, 并對其氨基酸序列進行生物信息學分析, 發(fā)現(xiàn)其同樣含有這些保守結構, 說明俄羅斯鱘補體C7具有抵抗外源病原體保護機體的免疫功能。

研究基因的組織分布模式有助于初步了解這些基因的生理功能。補體基因作為一種免疫分子,普遍存在于生物體各個組織, 并參與生物體抵抗病原微生物的入侵過程。熒光定量PCR分析表明,AgC7基因在健康俄羅斯鱘13種組織中均表達良好,但不同組織間的表達水平差異很大, 且在腸中表達水平最高, 一方面表明補體C7在各個組織中起著廣泛的作用, 執(zhí)行相同的免疫防御功能; 另一方面不同組織差異性的表達模式可能反應了不同組織特有的生物學作用, 這與其他水生動物的表達特征有些不同。研究發(fā)現(xiàn), 草魚補體C7在心臟、頭腎、腸、肝、皮膚、脾、后腎中表達, 且在肝臟中表達水平最高, 在血液、腦、鰓、肌肉中不表達[18];補體C7-1和C7-2在腦、眼、鰭、鰓、心臟、頭腎、腸、肝、肌肉、脾中均表達, 且均在肝臟中表達水平最高, 在其他組織中表達量不同[21]; 虹鱒補體C7在腎、脾中不表達, 在其他組織中均表達[19]。用含殼寡糖的飼料飼喂健康的俄羅斯鱘60d, 組織中補體C7基因的表達水平均上調。殼寡糖對免疫器官及多種免疫細胞有重要的免疫調節(jié)作用, 激活補體系統(tǒng)并能誘導分泌細胞因子, 完善了機體免疫系統(tǒng), 促進機體免疫反應, 進而發(fā)揮免疫增強的作用[6,23]。由于近幾年養(yǎng)殖環(huán)境的變化及國家對養(yǎng)殖安全的高度重視, 因此尋求綠色環(huán)保的水產養(yǎng)殖病害防治方法迫在眉睫。目前, 殼寡糖在禽畜方面的應用存在很多的報道, 例如肉雞(Broilers)[24]、鼠(Mice)[25]、豬(Growing pigs)[26], 大多數(shù)研究證明殼寡糖可以增強機體免疫力, 是一種無污染、無殘留的飼料添加劑。在水產動物方面研究發(fā)現(xiàn), 在殼寡糖的刺激作用下, 三疣梭子蟹血淋巴中的過氧化物酶活性會增強; 在基礎飼料中添加適量的殼寡糖也可以顯著提高魚類等免疫調節(jié)能力。本研究探討了殼寡糖能夠誘導俄羅斯鱘補體C7基因的表達, 進而增強機體免疫。

補體C7, 作為膜攻擊復合物的重要組成成分,在抵御外源細菌或真菌的入侵中起重要作用。目前對魚類補體C7生物學活性的研究主要集中在抗菌和抗病毒等免疫活性方面。草魚在嗜水氣單胞菌(革蘭氏陰性菌)感染后, 頭腎中的補體C7上調表達量最明顯, 在第7天達到峰值, 肝、脾、后腎組織補體C7基因表達量也呈現(xiàn)上調趨勢[18]。鰱補體C7基因在健康個體中只在脾中表達, 而感染嗜水氣單胞菌12h后,C7基因在腦、鰓、心、腎、腸、肝、脾7種組織中迅速表達, 隨著病原菌感染時間增加, 補體C7基因的表達量逐漸降低直至恢復正常水平[20]。在俄羅斯鱘感染嗜水氣單胞菌后, 血液、鰓、頭腎、腸、肝和脾6種組織中AgC7基因的表達均上調, 說明俄羅斯鱘AgC7對嗜水氣單胞菌的入侵具有快速響應作用, 機體大量表達AgC7以抵御細菌感染。隨著感染時間的推移, 俄羅斯鱘AgC7基因的表達量也逐漸下降, 恢復至正常水平,這與Ewart等[18]的研究報道一致。由此推測, 俄羅斯鱘AgC7在抵抗細菌感染中具有重要作用。

圖 4 嗜水氣單胞菌感染健康俄羅斯鱘后補體C7基因在免疫組織中的實時定量分析Fig. 4 The expression level of AgC7 in immune tissues after challenging the Russian sturgeon with Aeromonas hydrophila血液(Bl)、鰓(Gi)、頭腎(Hk)、腸(In)、肝臟(Li)、脾(Sp); 用SPSS 19.0軟件, 采用單因子方差分析法(One-Way ANOVA)分析數(shù)據(jù)差異性, 圖中“a, b, c”為SPSS軟件中Duncan算法計算出的子集分組; 有相同字母表示差異不顯著(P＞0.05), 無相同字母表示差異顯著(P＜0.05)Blood (Bl), gills (Gi), head kidney (Hk), intestine (In), liver (Li), spleen (Sp). Statistical analysis of differences was done by one-way analysis of variance (ANOVA) using SPSS v19.0 software, the letters “a, b, c” are subsets by Duncan algorithm. The same letters indicated that there was no significant difference in groups (P＞0.05), the different letters indicated that there was significant difference in groups(P＜0.05)

俄羅斯鱘AgC7具有典型的補體C7基因特征,且殼寡糖刺激和病原感染后均可引起AgC7基因表達變化, 補體C7可能參與了俄羅斯鱘的免疫應答。