曼氏無針烏賊神經肽sCAP基因克隆與組織表達定位

李 穎 周宇鑫 單雨菡 黃 偉 劉慧慧 平洪領 史會來 遲長鳳

(1. 浙江海洋大學海洋科學與技術學院，國家海洋設施養殖工程技術研究中心，海洋生物種質發掘與利用國家地方聯合實驗室，舟山 316022; 2. 浙江省海洋水產研究所，舟山 313021)

神經肽是調節動物生理活動的小分子多肽[1]。大量研究表明神經肽在許多軟體動物特別是頭足綱動物的生理調節中發揮重要作用[2]。然而, 目前關于頭足類神經肽的研究主要集中在如GnRH、FaRPs和APGWamide等小分子多肽方面[3], 而在生理調節過程中意義重大的小分子肽——小心激肽(Small cardioactive peptide, sCAP)的研究較少。sCAP在刺激心臟運動[4]、控制肌肉收縮[5]、輸卵管收縮、增強后腸收縮[6]及生物蛻皮等生理過程中有重要作用[7]。sCAP最初發現于長蛸(Octopus minor)的腦組織中, 有Ocp-1、Ocp-2、Ocp-3和Ocp-4四種類型[8]。其相關類似物oct-SCPRP也被發現于真蛸(Octopus vulgaris)中, 具有收縮齒舌牽拉肌的作用[9]。有研究表明Ocp-1和Ocp-2是非洲大蝸牛(Achatina fulica)中Achatin-1的同源基因產物, Ocp-1可通過影響脈紅螺(Rapana venosa)中谷氨酸含量刺激心臟收縮[3,10]。綜上, 開展sCAP及其生理功能研究具有重要意義。

曼氏無針烏賊(Sepiella japonica)是一種具有很高的營養價值和藥用價值的經濟頭足類, 曾經是東海“四大海產”之一[11]。20世紀70年代以后, 曼氏無針烏賊種質資源出現衰退, 產量明顯下降, 為保護這一珍貴物種, 開展其人工繁育就顯得尤為重要[12]。本研究團隊在前期大量研究的基礎上, 采用cDNA末端快速克隆的技術(RACE)克隆獲得曼氏無針烏賊sCAP基因的cDNA全長序列并開展生物信息學分析；采用熒光定量PCR(qRT-PCR)技術研究sCAP基因在曼氏無針烏賊雌性和雄性個體不同組織中表達的差異性；采用原位雜交(in situhybridization, ISH)技術對曼氏無針烏賊sCAP基因mRNA在腦組織中進行細胞定位, 進而推測sCAP基因在曼氏無針烏賊中的可能生理功能, 并為曼氏無針烏賊的種質資源保護和開發奠定一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗選取性成熟時期的健康、活力強的曼氏無針烏賊(80—100 g)[13], 從浙江溫州蒼南頭足類苗種繁育基地取樣, 活體解剖心、腦、視葉、肌肉、胰、胃、腸、肝、鰓、性腺(精巢和卵巢)、纏卵腺和副纏卵腺等組織于裝有RNA保存液(CWBIO公司)的凍存管中保存, 用干冰運回實驗室后-80℃的超低溫冰箱中保存備用。體外解剖成熟曼氏無針烏賊的完整腦組織, 立即于暗處置于預冷的4%多聚甲醛溶液中固定過夜, 然后將組織轉移至75%乙醇溶液中帶回實驗室。

1.2 實驗方法

總RNA提取以及cDNA第一條鏈的合成曼氏無針烏賊各個組織總RNA使用RNAiso Plus(TaKaRa公司)進行提取。2 μg總RNA用于cDNA第一條鏈的合成, 實驗方法參照M-MLV(Rnase H-)反轉錄試劑盒(TaKaRa公司)說明書方法進行。

曼氏無針烏賊sCAP基因核心序列的克隆根據NCBI已有的商烏賊(Sepia officinalis, AFS32 691.1)和真蛸(AB198190.1)的sCAP基因序列, 設計曼氏無針烏賊sCAP基因核心片段的簡并引物, 見表 1中sCAP-F/sCAP-R。

采用25 μL PCR體系根據PremixTaq試劑(TaKaRa公司)說明書進行, PCR產物經過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至上海華大基因進行測序。

曼氏無針烏賊sCAP基因cDNA全長的克隆根據SjsCAP的核心序列設計5′ RACE(sCAP-5′outer/sCAP-5′ inner, 表 1)和3′RACE(sCAP-3′outer/sCAP-3′ inner, 表 1)的引物。全長cDNA的擴增根據SMARTTMRACE試劑盒(TaKaRa公司)說明書進行, PCR產物經純化、連接、轉化最后將菌液送至上海華大基因測序。

表 1 克隆sCAP基因所用引物Tab. 1 Primers used in sCAP gene cloning

曼氏無針烏賊sCAP基因cDNA全長序列分析及生物信息學分析采用DNAMAN軟件對測序結果進行拼接分析, 獲得SjsCAP基因的全長序列；在NCBI上預測其ORF區；利用在線軟件Expasy-ProtParam (http://we-b.expasy.org/protparam/)[14]將其翻譯為氨基酸序列并預測蛋白的相對分子量和等電點；采用TMHMM Server v. 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對sCAP跨膜結構域進行預測；采用SignalIP[15](http://www.cbs.dtu.dk/service/SignalP/)預測蛋白質序列中的信號肽, 利用NetNGly 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)預測蛋白的糖基化位點；利用NetPhos 3.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預測蛋白的磷酸化位點；利用ClustalX[16]將Sjs-CAP與已知物種的心激肽基因氨基酸序列進行同源性比對；用MrBayes v3.2.6軟件[17]采用貝葉斯推理的方法(BI)構建系統進化樹。

曼氏無針烏賊sCAP基因的組織表達特異性分析選取成熟烏賊的組織：腦、視葉、心、鰓、肝、胃、胰、腸、肌肉、性腺(精巢和卵巢)、纏卵腺、副纏卵腺。雌雄各選擇3只烏賊做3次生物學重復, 每個個體的每個組織的定量表達做3次機械重復。選擇曼氏無針烏賊β-actin基因(JN56 4496.1)作為內參, 通過qRT-PCR的方法對SjsCAP基因的組織表達特異性進行分析, 選取肌肉組織作為最小參照, 采用2-ΔΔCt方法計算相對表達量, 數據用SPSS軟件進行單因素方差分析及T檢驗, 處理組之間的顯著性差異(P＜0.05), 用Origin8制圖軟件繪制圖表。引物信息見表 2。

各種組織的總RNA提取和cDNA第一鏈合成的方法采用實驗方法中所述。400 ng的cDNA模版用于qRT-PCR, 加樣體系及反應條件按照SYBR Premix ExTaqTMII Kit (TaKaRa公司)產品說明書操作。

曼氏無針烏賊神經肽sCAP基因腦組織表達定位分析sCAP原位雜交探針以烏賊腦組織cDNA為模板進行普通PCR擴增, 純化的探針模板根據探針標記試劑盒(DIG RNA Labeling kit SP6 /T7 kit, 羅氏)說明書進行探針標記。正義探針與反義探針制作方法相同引物為A1F/A1R和B1F/B1R(表 2), 正義探針作為對照組。將成熟曼氏無針烏賊腦組織采用4%多聚甲醛固定過夜, 采用不同濃度酒精梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片。石蠟切片經二甲苯脫蠟、水化后, 蛋白酶K 37℃處理20min。組織切片在42℃雜交液中預雜交1h, 同樣溫度下與探針雜交過夜, 10% Blocking溶液室溫封閉1h, 加1∶500稀釋的二抗Anti-DIG-AP 4℃過夜, 在室溫下NBT/BCIP染色30min, 封片, Olympus CX31顯微鏡下觀察拍照。

表 2 SjsCAP熒光定量和原位雜交引物Tab. 2 Primers of SjsCAP used for qRT-PCR and in situ hybridization assay

2 結果

2.1 曼氏無針烏賊sCAP基因cDNA全長分析

曼氏無針烏賊神經肽sCAP基因cDNA全長696 bp, 由111 bp的5′ 非編碼區(UTR)、編碼86個氨基酸的261 bp開放閱讀框(ORF)和324 bp的3′-UTR組成, 預測的蛋白質相對分子量(MW)為9.331 kD,等電點(pI)為8.52。通過在線軟件對該蛋白進行生物學信息分析, 該蛋白具有信號肽在1—20號氨基酸位點；含有一個跨膜區域, 7—29號氨基酸為跨膜區域, 含有1個糖基化位點在5號位點；含有6個絲氨酸(Ser)位點, 位于3、7、23、35、72和79號位點, 3個蘇氨酸(Thr)位點, 位于18、22和76號位點,1個酪氨酸(Tyr)位點, 位于24號位點。

2.2 曼氏無針烏賊sCAP同源性分析及系統進化樹建立

從NCBI選取商烏賊(AFS32691.1)、加州雙斑蛸(Octopus bimaculoides, XP_014771607.1)、真蛸(BAE66649.1)、海蝸牛(Aplysia californica, XP_012943902.1)以及太平洋牡蠣(Crassostrea gigas,NP_001292304.1)的sCAP基因氨基酸序列與曼氏無針烏賊sCAP基因氨基酸序列進行對比, 結果表明曼氏無針烏賊sCAP基因與商烏賊同源性最高達到90%, 與加州雙斑蛸及真蛸的同源性分別為66%和54%, 與海蝸牛及長牡蠣的同源性低于40%。我們在NCBI中選取了54條已知與sCAP基因有相同功能的其他物種的心激肽氨基酸同源序列, 基于貝葉斯推理方法進行進化樹的構建, 在建樹時建立4個馬爾可夫鏈, 每100代進行一次抽樣, 共運行200萬代,計算后驗概率(Posterior probability)。結果表明與曼氏無針烏賊親緣關系最近的是商烏賊, 其次是加州雙斑蛸和真蛸, 與海蝸牛以及太平洋牡蠣等軟體動物匯聚為一大支, 與果蠅屬等節肢動物的親緣關系較遠(圖 1)。

2.3 曼氏無針烏賊sCAP基因組織表達特異性分析

SjsCAP在成熟雌雄個體各個組織中均有一定量表達, 其中在視葉中表達量最高, 腦次之, 在雄性內臟器官胰臟中表達量也較高。在雄性個體中, 視葉和腦與其他組織中SjsCAP表達量具有顯著性差異(用abc表示)；在雌性個體中視葉的表達量最高且與其他組織有顯著性差異。在雌性與雄性視葉組織之間SjsCAP表達量也有顯著性差異, 且雄性視葉組織的表達量是雌性的3.4倍。在雌性與雄性腦組織之間SjsCAP表達量也有顯著性差異, 且雄性腦組織的表達量是雌性的4.5倍(圖 2)。

2.4 曼氏無針烏賊神經肽sCAP基因腦組織表達定位分析

利用原位雜交技術對曼氏無針烏賊sCAP基因mRNA在腦組織中的表達位點進行細胞定位。如圖 3所示, 在烏賊腦組織的多個區域均能觀察到清晰的sCAP基因mRNA陽性雜交信號, 而用正義探針進行雜交的圖 3A中不能觀察到信號。烏賊腦組織的3個部分組成：食道上神經團、食道下神經團和視葉[11]。在曼氏無針烏賊腦的食道上神經團的垂直葉及亞垂直葉均能觀察的陽性雜交信號(圖3B)；在背外側葉、視腺及腦腳葉也可以觀察到陽性雜交信號(圖 3C)；在視葉細胞中也可觀察到較強的陽性雜交信號(圖 3D—F)。

3 討論

圖 1 基于SjsCAP同源氨基酸序列構建的貝葉斯系統進化樹Fig. 1 Bayesian methods evolutionary trees based on SjsCAP homologous amino acid sequences后驗概率表示在分支節點, 所有氨基酸序列號來自于GenBankPosterior probability is indicated by numbers at the nodes, all protein sequences were obtained from GenBank

本研究首次克隆得到曼氏無針烏賊的sCAP基因的cDNA全長序列, 通過對該基因的生物學信息分析, 我們推測該蛋白是由細胞內分泌到細胞外調節各項生理功能。這些生物信息學分析與蛋白定位、生理功能、信號轉導、基因表達調控有關[18]。通過qRT-PCR表達分析,sCAP的表達在雄性及雌性曼氏無針烏賊的視葉中被明顯檢測到, 其次是腦,可以推測sCAP是通過控制曼氏無針烏賊的神經系統來控制其活動。sCAP在纏卵腺及副纏卵腺中微量表達說明其可能與輸卵管的收縮功能有關[19]。從表達量分析, 雄性個體的表達量明顯高于雌性個體, 表達量最顯著的視葉組織雄性的表達量與雌性之間也有顯著性差異, 可能因為不同性別的組織差異性導致的, 推測該基因在控制雌雄個體生理活動時可能存在性別差異, 還需進一步實驗驗證。有研究學者用RT-PCR的方法對昆蟲中的甲殼類心激肽(Crustacean cardioactive peptide, CCAP)進行了研究, 結果顯示其在不同發育階段都有表達, 表達最多的是在幼蟲到蛹過渡的階段[20]。表達水平波動在幾個發育階段的過程中, 直到發育后期一些細胞依然沒有表達[20,21], 細胞內刺激識別的神經元可以引起心臟運動加速[22,23]。因此,sCAP在曼氏無針烏賊中不同時期的表達量將作為下一步研究工作。有研究表示小心激肽SCP在靜水椎實螺(Lymnaea stagnalis)的內臟和右頂葉神經節以及左側頂葉神經節中有免疫反應性[24,25]。有研究表明在煙草天蛾(Manduca sexta)腦中觀察到9對細胞被CCAP原位探針標記[26], 同時采用RT-PCR、免疫組化和原位雜交技術在東方果蠅(Bactrocera dorsalis)[27]、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)[23]、水蚤(Daphnia longicephala)[28]、長紅錐蝽(Rhodnius prolixus)[29]的中樞神經系統檢測到CCAP的表達。本文的研究結果也在中樞神經系統中檢測到陽性信號, 與上述研究結果一致。

圖 2 雄性和雌性曼氏無針烏賊sCAP不同組織表達特異性Fig. 2 The relative SjsCAP mRNA level in various tissues of male and female S. japonica

圖 3 曼氏無針烏賊sCAP基因mRNA的腦組織原位雜交Fig. 3 In situ hybridization of sCAP mRNA in brain of S. japonicaA. 正義探針對照(視葉); B. 垂直葉(VL), 亞垂直葉(SVL), 食道(OES); C. 背外側葉(DLL), 視腺(OG), 腦腳葉(PL); D. 視葉; E. 視葉(OL); F. 視葉細胞(40倍鏡); 黑色尖頭指示陽性區域, 標尺長度標注在圖片右下角A. a medial sagittal section of the anterior basal lobe stained with the sense sCAP probe; B. vertical lobe (VL), subvertical lobe (SVL),esophagus (OES); C. dorsolateral lobe (DLL), optic gland (OG), peduncle lobe (PL); D. optic lobe; E. optic lobe (OL); F. optic lobe cells for 10×40 times. The black arrows indicate positive signals. Scale bars in the lower right corner of the picture

目前有關于心激肽的研究主要集中在甲殼類、昆蟲類以及腹足類。黑化誘導神經肽(Corazonin)是從美洲大蠊(American cockroach)中被發現的, 研究表明它可以刺激心臟加速運動[30]；CAPs和CAP2是存在于昆蟲的中樞神經系統, 也同樣具有刺激心臟運動的功能[31], CAP2還參與胚胎發育中腸道運動的調節[32]；SCP和SCPB被稱為小心激肽, 它們不僅可以刺激心臟運動[4,33], 還可以控制肌肉的收縮[5]；LCP被稱為大心激肽, 研究表明它可能具有刺激心臟運動的作用[34]；CCAP最初是從三葉真蟹(Carinus maenas)的圍心器官中被發現的[35], 它不僅可以刺激心臟運動和參與滲透壓調節和淡水適應性[23],還參與生物的蛻皮[7]、刺激輸卵管收縮[6]、增強后腸的收縮[26]、控制肌肉的收縮、調節包括視覺和嗅覺在內的各種神經系統的功能[7], 此外還具有作為脂肪動力激素釋放因子的作用[6]和調節口腔胃神經節等功能[36]。此外, 分離純化于海兔心臟的心激肽(NdWFamide)能夠通過激活G蛋白途徑提高海兔心室肌細胞的L-型Ca2+流[37]；首次分離于羅馬蝸牛(Helix pomatia)中的軟體動物的CCAP相關肽(MCCAP)是靜水椎實螺口腔攝食網絡潛在的外部調節器[38]；頭足類中的商烏賊CCAPs通過參與輸卵管中卵的轉運和卵囊物質的機械分泌來參與產卵調控, 進一步的免疫組化實驗結果表明, 商烏賊CCAP定位于中樞神經系統和與卵膜合成和分泌相關腺體的神經末梢、下食道神經團[39]。

綜上所述, 本文所研究的曼氏無針烏賊心激肽sCAP是首次通過基因克隆的方法在烏賊中獲得其基因cDNA全長, 通過多序列比對發現與其他近緣物種有保守的進化關系, 組織特異性表達說明其在不同組織表達可能與多種功能相關, 原位雜交實驗說明在曼氏無針烏賊腦中的表達部位可能是控制該基因的功能區域。今后我們會對該基因的細胞定位以及生理功能驗證方面開展深入研究。