團頭魴外周血細胞的顯微結構及細胞化學特征

陳婷婷 任秋楠 陳嫻嫻 曹新芳 黃卉卉 張盛周

(安徽師范大學生命科學學院, 安徽省重要生物資源保護與利用重點實驗室, 蕪湖 241000)

血細胞是動物血液的重要組成部分, 脊椎動物血細胞可分為紅細胞、白細胞和血栓細胞三類, 分別在機體內的氣體運輸、免疫防御和凝血中發揮重要作用[1—3]。血細胞對動物自身生理狀態變化和外界環境因子刺激十分敏感, 其形態結構和數目與動物的生理機能和健康狀況密切相關, 相關參數對于動物的健康監測和疾病診斷有重要意義[2,3]。

目前對哺乳動物特別是人類血細胞的種類、結構和功能已有較全面而深入的認識。隨著魚類養殖業的不斷發展, 對魚類外周血細胞的研究也已廣泛開展, 有學者對鱖(Siniperca chuatsi)[4]、海鰻(Muraenesox cinereus)[5]、中華鱘(Acipenser sinensis)[6]等魚類外周血細胞的顯微及亞顯微結構進行了觀察, 亦有學者對齊口裂腹魚(Schizothorax prenanti)[1]、花斑裸鯉(Gymnocypris eckloni)[7]、鋸蓋魚(Centropomus parallelus)[8]、玉麗體魚(Cichlasoma dimerus)[9]等魚類外周血細胞的細胞化學特征和功能進行了研究探討, 這些研究表明不同魚類外周血細胞的形態結構與功能既有一定的共性, 也有明顯的物種特異性。

團頭魴(Megalobrama amblycephala)隸屬硬骨魚綱鯉形目鯉科魴屬, 又稱武昌魚, 主要分布于長江中下游的附屬湖泊中, 為我國特有魚種。因其肉質鮮嫩、營養價值高且易飼養, 自1990年起, 該魚被引種到全國各地, 成為我國主要淡水養殖魚類之一。隨著團頭魴養殖產業的擴大, 對其基礎生物學研究也在不斷深入開展。在血細胞方面, 吳維寧[10]對團頭魴腎臟、肝臟、脾臟及小腸等造血器官中血細胞的發育過程進行了研究; 鄒曙明等[11]對多倍體團頭魴紅細胞的形態、體積及數量進行了研究,并探討了紅細胞的表觀遺傳特征。但團頭魴外周血細胞的形態結構和細胞化學組分尚未見報道。本文采用常規瑞氏和7種細胞化學染色方法對團頭魴外周血細胞的顯微結構與細胞化學特征進行了研究, 旨在增進對團頭魴血細胞的類型、結構與功能的認識, 為團頭魴的健康檢測及病理診斷提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鮮活的團頭魴購自蕪湖市黃山西路農貿市場,雌雄各4尾, 體重約500 g, 無明顯傷病。

1.2 血細胞涂片制備

用鈍器敲擊團頭魴后腦, 將其敲暈后, 用注射針在尾靜脈取血并迅速注入有抗凝劑的采血管內。取血結束后立刻涂片, 每條魚制作40張血涂片,室溫下自然晾干備用。一部分血涂片用于常規瑞氏染色, 觀察團頭魴各種外周血細胞的顯微形態;另一部分用于細胞化學染色, 研究團頭魴各種外周血細胞的細胞化學特征。

1.3 常規瑞氏染色

將血涂片置于濕盒中, 滴加0.5 mL瑞氏A染液使其覆蓋整個血涂片, 室溫下染色約30s; 再滴加等量的瑞氏B緩沖液, 用吸耳球將溶液吹勻, 靜置染色10min, 用蒸餾水緩慢沖掉染液, 室溫自然晾干, 鏡檢。

1.4 細胞化學染色

細胞化學染色方法參照文獻[12]中進行, 略有改良。

過碘酸-雪夫(PAS)反應顯示糖類血涂片經95%的乙醇溶液固定10min后, 置于 10 mg/mL的高碘酸溶液氧化15—20min, 蒸餾水沖洗3次, 再用雪夫染液室溫染色45min; 亞硫酸溶液漂洗3—4次,再用蒸餾水緩慢沖洗干凈; 20 mg/mL的甲基綠溶液復染約15min, 蒸餾水沖洗, 室溫自然晾干, 鏡檢。

蘇丹黑B(SBB)染色法顯示脂類血涂片經甲醛蒸汽固定后, 用蘇丹黑B染色液37℃染色40min; 然后先用70%的乙醇溶液沖洗3—4次, 再用蒸餾水繼續沖洗1min, 最后用瑞氏染色液復染30min, 蒸餾水沖洗, 室溫自然晾干, 鏡檢。

Gomori硫化鉛法顯示酸性磷酸酶(ACP)血涂片經甲醛蒸汽固定后, 置于作用液(12 mL醋酸緩沖液pH 7.4, 50 mg/mL硝酸鉛2 mL, 32 mg/mL β-甘油磷酸鈉4 mL)中, 37℃反應4h后用蒸餾水洗凈;室溫待干后, 置于2%的硫化銨溶液中顯色1—2min,蒸餾水沖洗干凈后, 20 mg/mL的甲基綠染液復染15min, 蒸餾水沖洗, 室溫自然晾干, 鏡檢。

卡氏偶氮偶聯法顯示堿性磷酸酶(AKP)血涂片經10%的甲醛甲醇溶液固定30s后, 置于作用液(α-磷酸萘酚鈉20 mg, 0.05 mol/L丙二醇緩沖液20 mL, 固醬紫GBC鹽20 mg)中, 室溫反應15—20min,蒸餾水洗凈; 蘇木素染液復染5—8min, 蒸餾水洗凈, 室溫自然晾干, 鏡檢。

四甲基聯苯胺法顯示過氧化物酶(POX)將2 mL 0.1%的四甲基聯苯胺乙醇溶液和20 μL亞硝基鐵氰化鈉飽和溶液混勻后, 滴加在血涂片上,室溫反應1min, 再滴加0.7 mL稀H2O2溶液, 用洗耳球吹勻后, 繼續染色6min; 然后用蒸餾水沖洗3—4次, 瑞氏染液復染15—20min, 蒸餾水洗凈, 室溫自然晾干, 鏡檢。

氯乙酸萘酚(AS-DCE)染色法顯示特異性酯酶血涂片經1 0%的甲醛甲醇溶液固定30s—1min后, 置于作用液(10 mg氯乙酸AS-D萘酚,0.5 mL丙酮, 5 mL磷酸緩沖液pH 7.4, 10 mg固醬紫GBC鹽)中37℃反應30min, 然后用蒸餾水將染液沖去, 蘇木素染液復染5min, 蒸餾水洗凈, 室溫自然晾干, 鏡檢。

酸性α-醋酸萘酚(ANAE)染色法顯示非特異性酯酶血涂片經0.68%的甲醛生理鹽水固定5min后, 用蒸餾水緩慢沖洗3—5次, 然后將作用液(0.067 mol/L磷酸緩沖液10 mL、10 mg/mL α-醋酸萘酚0.2 mL、10 mg固醬紫GBC鹽)滴加在血涂片上37℃反應1h, 用蒸餾水沖洗3—4次, 10 mg/mL的甲基綠染液復染5—15min, 蒸餾水洗凈, 室溫自然晾干, 鏡檢。

1.5 染色結果評價

根據Tavares-Dias[13]的評價方法, 將陽性區域超過細胞質面積 3/4 以上的記為強陽性(+++); 占1/2 為陽性(++); 面積不足1/2的為弱陽性(+)。沒有陽性反應則記為陰性(—)。其中, 陽性反應強度與細胞染色深淺呈正比。

1.6 測量和數據處理

用Olympus BX61 型顯微鏡在100倍視野下對血細胞形態和細胞化學染色進行觀察拍照和計數,雌雄個體各4尾, 每條計數1000個細胞, 統計出各種白細胞和血栓細胞的平均百分比; 用測微尺對細胞大小進行測量, 各雌雄個體每種細胞各測量20個;使用SPSS 19.0數據分析軟件對數據進行單因素方差分析(one-way ANOVA), 求出平均值并比較數據間的差異顯著性,P＜0.05為差異顯著,P＜0.01為差異極其顯著。

2 結果

2.1 血細胞的顯微結構

在光鏡下, 在團頭魴外周血細胞中可區分出紅細胞、白細胞和血栓細胞。白細胞包括淋巴細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞。

紅細胞紅細胞約占血細胞總數的93.3%。成熟紅細胞一般呈橢圓形, 表面光滑, 細胞核通常為橢圓形或圓形, 位于細胞中央, 其染色質較為致密, 經瑞氏染色后細胞核呈紫紅色, 而細胞質為均勻的灰色或淺黃色。此外, 偶爾可見體積較小、核質疏松的幼稚紅細胞(圖 1A)和由紅細胞分解形成的淺粉色斑點, 即為“核影”(圖 1B)。在團頭魴的雄性個體中, 紅細胞胞體體積和胞核體積均比雌性紅細胞小, 其中胞核體積在雌雄性之間差異顯著(P＜0.05), 而胞體體積差異極其顯著(P＜0.01, 表 1)。

淋巴細胞淋巴細胞為白細胞中數量最多的細胞, 一般為圓形或近圓形, 表面較為光滑。細胞核染色呈深紫色, 常偏于細胞一側或位于細胞中央, 核質比較大, 在細胞核周圍只能看到薄薄的一層淺藍色胞質(圖 1C)。

單核細胞單核細胞體積較大, 細胞長徑約11.0—14.5 μm, 通常為圓形或梨形, 少數為不規則形狀, 細胞表面不平整, 細胞核呈圓形或橢圓形, 占細胞體積的1/3至1/2。核內染色質較為疏松, 呈網狀, 染色較淺, 一般為淺紫色, 而細胞質為淺藍色,其中可見空泡狀結構(圖 1D)。

嗜中性粒細胞嗜中性粒細胞呈圓形或近圓形, 細胞核較小, 常偏于細胞一側, 形狀不規則,有腎形、圓形、橢圓形及分葉形。由于其染色質較為致密, 細胞核呈深紫色, 細胞質則為淡藍色, 核質界限清晰(圖 1E)。

嗜酸性粒細胞嗜酸性粒細胞為白細胞中數量最少的細胞, 胞體為圓形, 細胞核為橢圓形或腎形, 偏于細胞一側。細胞質中可觀察到大量紫紅色、粗大的顆粒, 有時會覆蓋在細胞核之上(圖 1F)。

血栓細胞血栓細胞體積較小, 細胞長徑約4.5—6.5 μm, 細胞形態多樣, 主要有梭形、淚滴形、橢圓形及長桿形等四種形態。核質比很大, 染色質致密, 染色后顯紫色, 細胞質極少, 近于無色(圖 1G)。常可見多個血栓細胞聚集在一起(圖 1H)

2.2 白細胞和血栓細胞的大小和比例

在白細胞和血栓細胞中, 單核細胞體積最大、其次為嗜酸性粒細胞和嗜中性粒細胞, 淋巴細胞和血栓細胞顯著較小(表 1)。雄性個體淋巴細胞和嗜中性粒細胞體積顯著小于雌性(P＜0.01); 雄性個體單核細胞體積略小于雌性, 且雄性個體細胞短徑顯著小于雌性(P＜0.05); 雌雄個體中嗜酸性粒細胞體積無顯著性差異(P＞0.05); 血栓細胞為團頭魴外周血細胞中體積最小的細胞, 在細胞長徑上顯現出了性別之間的差異, 雄性個體中細胞長徑顯著小于雌性(P＜0.05)。

圖 1 團頭魴外周血細胞的顯微結構Fig. 1 The microscopic structure of peripheral blood cells in Megalobrama amblycephalaA. 幼稚紅細胞 (IE); B. 核影紅細胞 (NSE), 成熟紅細胞 (ME); C. 淋巴細胞 (L); D. 單核細胞 (MO); E. 嗜中性粒細胞 (NE); F. 嗜酸性粒細胞 (EO); G. 單個血栓細胞 (THR); H. 聚集血栓細胞 (THR); 標尺: 5 μmA. immature erythrocyte (IE); B. nuclear shadow erythrocyte (NSE), mature erythrocyte (ME); C. lymphocyte (L); D. monocyte (MO); E.neutrophil (NE); F. eosinophil (EO); G. single thrombocyte (THR); H. aggregate thrombocytes (THR); Scale bar = 5 μm

在白細胞和血栓細胞中, 淋巴細胞數量最多,在雌雄性中所占比例分別約為58.8%和59.9%; 血栓細胞其次, 在雌雄性中分別約占28%和22%; 單核細胞在雌雄性中所占比例分別約為10.3%和10.7%; 嗜中性粒細胞顯著較少, 在雌雄性中所占比例分別約為2.7%和6.2%; 嗜酸性粒細胞數量最少, 在雌雄性中都僅約占0.2%。雄性個體嗜中性粒細胞顯著多于雌性(P＜0.05), 其他白細胞和血栓細胞的比例在雌雄性之間均無顯著差異(P＞0.05, 圖 2)。

表 1 團頭魴外周血細胞的形態學參數Tab. 1 The morphological parameters of peripheral blood cells in Megalobrama amblycephala (Mean±SD, μm)

圖 2 團頭魴分類白細胞及血栓細胞的比例Fig. 2 The proportion of classified leucocytes and thrombocyte in Megalobrama amblycephala不同字母(a, b, c, d, e)表示雄性團頭魴不同種類細胞類型之間差異顯著 (P＜0.05); * 表示雌雄之間差異顯著(P＜0.05)Different letters (a, b, c, d, e) indicate the significant difference among different types of blood cells in Megalobrama amblycephala(P＜0.05); * indicates that the difference between male and female is significant (P ＜0.05)

2.3 白細胞和血栓細胞的細胞化學特征

過碘酸-雪夫反應(PAS)所有白細胞和血栓細胞胞質均呈紅色(圖 3a1—a5), 其中, 單核細胞胞質中紅色顆粒稍多, 反應為陽性(圖 3a2), 其他細胞紅色較淺, 均為弱陽性(圖 3a1、a3—a5)。

蘇丹黑B(SBB)單核細胞、嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞反應均為陽性, 細胞質內分布著棕色的細小顆粒(圖 3b2—b4)。而淋巴細胞和血栓細胞胞質接近于無色, 且不含染色顆粒, 反應為陰性(圖 3b1、b5)。

酸性磷酸酶(ACP)單核細胞和嗜中性粒細胞反應呈強陽性(圖 3c2、c3), 細胞質中含有大量的棕黑色顆粒, 呈彌散狀分布; 嗜酸性粒細胞為陽性反應, 胞質中顆粒數量較少, 顏色較淺(圖 3c4);而淋巴細胞和血栓細胞沒有棕色顆粒存在, 為陰性反應(圖 3c1、c5)。

堿性磷酸酶(AKP)所有白細胞和血栓細胞胞質內均無染色顆粒, 均為陰性反應(圖 3d1—d5)。

過氧化物酶(POX)單核細胞、嗜中性粒細胞及嗜酸性粒細胞反應均為強陽性, 細胞內含有大量的紫黑色顆粒, 幾乎覆蓋整個胞質(圖 3e2—e4)。而淋巴和血栓細胞胞質中不含有染色顆粒, 為陰性反應(圖 3e1、e5)。

圖 3 團頭魴外周血細胞的細胞化學染色Fig. 3 The cytochemical staining of peripheral blood cells in Megalobrama amblycephalaa1—a5. 過碘酸-雪夫染色: a1. 淋巴細胞; a2. 單核細胞; a3. 嗜中性粒細胞; a4.嗜酸性粒細胞; a5. 血栓細胞; b1—b5. 蘇丹黑B染色: b1.淋巴細胞; b2. 單核細胞; b3. 嗜中性粒細胞; b4. 嗜酸性粒細胞; b5. 血栓細胞; c1—c5. 酸性磷酸酶染色: c1. 淋巴細胞; c2. 單核細胞;c3. 嗜中性粒細胞; c4. 嗜酸性粒細胞; c5.血栓細胞; d1—d5. 堿性磷酸酶染色: d1. 淋巴細胞; d2. 單核細胞; d3. 嗜中性粒細胞; d4. 嗜酸性粒細胞; d5. 血栓細胞; e1—e5. 過氧化物酶反應: e1. 淋巴細胞; e2. 單核細胞; e3. 嗜中性粒細胞; e4. 嗜酸性粒細胞; e5. 血栓細胞;f1—f5. 氯乙酸萘酚染色: f1. 淋巴細胞; f2. 單核細胞; f3. 嗜中性粒細胞; f4. 嗜酸性粒細胞; f5. 血栓細胞; g1—g5. 酸性-α-醋酸萘酯酶染色: g1. 淋巴細胞; g2. 單核細胞; g3. 嗜中性粒細胞; g4. 嗜酸性粒細胞; g5. 血栓細胞; L. 淋巴細胞; MO. 單核細胞; NE. 嗜中性粒細胞; EO. 嗜酸性粒細胞; THR血栓細胞; 標尺: 5 μma1—a5. Periodic acid Schiff staining: a1. lymphocyte; a2. monocyte; a3. neutrophil; a4. eosinophil; a5. thrombocyte; b1—b5. Sudan black B staining: b1. lymphocyte; b2. monocyte; b3. neutrophil; b4. eosinophil; b5. thrombocyte; c1—c5. Acid phosphatase staining: c1.lymphocyte; c2. monocyte; c3. neutrophil; c4. eosinophil; c5. thrombocyte; d1—d5. Alkaline phosphatase staining: d1. lymphocyte; d2.monocyte; d3. neutrophil; d4. eosinophil; d5. thrombocyte; e1—e5. Peroxidase staining: e1. lymphocyte; e2. monocyte; e3. neutrophil; e4.eosinophil; e5. thrombocyte; f1—f5. Naphythol AS-D chloroacetate esterase staining: f1. lymphocyte; f2. monocyte; f3. neutrophil; f4.eosinophil; f5. thrombocyte; g1—g5.α-naphthol acetate esterase staining: g1. lymphocyte; g2. monocyte; g3. neutrophil; g4. eosinophil; g5.thrombocyte; L. lymphocyte; MO. monocyte; NE. neutrophil; EO. eosinophil; THR. thrombocyte; scale bar = 5 μm

氯乙酸AS-D萘酚酯酶(AS-DCE)單核細胞細胞質中可見較多均勻分布的紅色細小顆粒, 呈陽性反應(圖 3f2), 其他白細胞及血栓細胞胞質中染色較淺或染色不均, 為弱陽性反應(圖 3f1、f3—f5)。

α-醋酸萘酚酯酶(ANAE)所有白細胞及血栓細胞反應均為陽性, 其中嗜酸性粒細胞陽性反應較強, 細胞質中均勻分布著紫紅色顆粒, 為強陽性(圖 3g4); 淋巴細胞、單核細胞和嗜中性粒細胞呈陽性反應(圖 3g1—g3); 血栓細胞反應較弱, 細胞質呈淺紫色, 且分布不均(圖 3g5)。

不同類型血細胞的細胞染色強度總結于表 2,淋巴細胞呈PAS及AS-DCE弱陽性, 呈ANAE陽性,其他染色均為陰性; 單核細胞POX和ACP染色為強陽性, PAS、SBB、AS-DCE和ANAE為陽性, 僅AKP染色為陰性; 嗜中性粒細胞呈ACP、POX強陽性, SBB和ANAE陽性, PAS和AS-DCE為弱陽性, 而AKP為陰性; 嗜酸性粒細胞為POX、ANAE強陽性,SBB、ACP陽性, PAS及AS-DCE為弱陽性, AKP為陰性; 血栓細胞呈PAS、AS-DCE及ANAE弱陽性,其他染色均為陰性。

表 2 團頭魴白細胞的細胞化學特征Tab. 2 Cytochemical characteristics of peripheral blood cells in Megalobrama amblycephala

3 討論

3.1 團頭魴外周血紅細胞的形態與大小

紅細胞的主要功能是通過血紅蛋白運輸氧氣。有研究顯示, 在脊椎動物中, 紅細胞的大小與物種的進化地位有關, 進化地位越低等, 其紅細胞體積越大[14,15]。如兩棲類的紅細胞大于爬行類,而爬行類的紅細胞又大于哺乳類[14]。但本研究顯示團頭魴紅細胞的體積要小于兩棲動物[15]。在其他大多數魚類, 如斑馬魚(Danio rerio)[16]、稀有白甲魚(Onychostoma rarus)[17]、齊口裂腹魚[1]等的紅細胞體積也均小于兩棲動物, 這與進化規律存在矛盾。此現象可與魚類的生活環境與生活習性有關, 研究表明, 紅細胞越小, 其攜氧能力越強[15], 魚類生活在水中且運動量相對較大, 而水中含氧量遠低于陸上空氣中, 因此, 為維持體內正常代謝,魚類對紅細胞攜帶氧氣能力有較高要求, 因而紅細胞體積較小。

團頭魴紅細胞體積在雌雄性別之間存在明顯的差異, 雄性的紅細胞胞體體積和胞核體積都顯著小于雌性, 此現象在其他魚類中尚未見報道。紅細胞越小, 其攜氧能力越強[15], 可滿足機體較強的代謝活動需求, 因而雄性團頭魴紅細胞體積較小可能與其代謝活動要強于雌性有關。

紅細胞的發育階段一般可分為幼稚期、未成熟期和成熟期。與哺乳動物不同, 團頭魴外周血細胞中存在幼稚期的紅細胞, 亦可觀察到紅細胞的無絲分裂相, 這種現象在其他魚類如海鰻[5]和斑馬魚[16]中也有報道, 表明魚類紅細胞的除在造血器官中產生外, 還可通過外周紅細胞直接分裂產生。

3.2 團頭魴外周血白細胞的種類和比例

本研究顯示, 團頭魴白細胞可分為單核細胞、淋巴細胞、嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞, 未見嗜堿性粒細胞。袁仕取等[4]曾指出大部分硬骨魚類不含有嗜堿性粒細胞, 其僅在少數魚類外周血細胞中出現。如在海鰻[5]、中華鱘[6]及胭脂魚(Myxocyprinus asiaticus)[18]中都不曾發現嗜堿性粒細胞。對于此現象, 有學者認為嗜堿性粒細胞為魚類血細胞中含量最少的顆粒細胞, 且主要存在于頭腎和脾臟中, 因此很難在外周血中發現[3]。亦有學者認為, 嗜堿性顆粒在制片過程中極易解體, 所以難以在外周血中觀察到[19]。

關于淋巴細胞大、小之分, 一直以來都存在爭議, 有學者在研究中將大、小淋巴細胞當作不同種類的細胞進行分析, 如張艷珍等[6]對中華鱘的研究,曹文芝等[16]對斑馬魚的研究。但本研究發現, 團頭魴淋巴細胞體積大小的變化是連續性的, 沒有嚴格的大小之分, 因此, 沒有用“大淋巴細胞”和“小淋巴細胞”來定義體積不同的淋巴細胞。趙海鵬等[20]研究認為, 體積不同的淋巴細胞可能只是不同發育階段的淋巴細胞, 而不是具有不同功能的不同種細胞。

在團頭魴白細胞中, 淋巴細胞數量最多, 嗜酸性粒細胞數量最少, 這與白甲魚[17]、海鰻[5]、中華鱘[6]等多數魚類相同, 表明魚類白細胞的比例在不同物種間具有一定的共性; 單核細胞和嗜中性粒細胞所占的比例則存在一定的物種特異性, 在團頭魴中, 單核細胞數量多于嗜中性粒細胞, 這與斑馬魚[16]相同, 而與中華鱘[6]、齊口裂腹魚[1]不同。

3.3 團頭魴血栓細胞的形態

和哺乳動物的血小板相似, 魚類血栓細胞是具有凝血作用的細胞, 大量研究表明, 血栓細胞是魚類外周血細胞中數量較多的細胞, 如在海鰻[5]、胭脂魚[18]等魚中, 血栓細胞是除紅細胞外數量最多的細胞。本研究顯示, 在團頭魴外周血中, 血栓細胞的數量僅次于淋巴細胞, 且常聚集分布。本研究發現團頭魴血栓細胞形態多樣, 主要有梭形、淚滴形、橢圓形及長桿形等4種形態。有學者認為血栓細胞的形態與取血時是否使用抗凝劑有關, 使用抗凝劑往往只能觀察到較少的細胞形態, 本研究取血時使用了抗凝劑, 但依然能觀察到多種形態的血栓細胞, 支持謝嘉華等[5]的觀點, 即血栓細胞的不同形態與細胞的不同發育時期或功能狀況有關。

3.4 團頭魴白細胞和血栓細胞的細胞化學特征

細胞化學染色是研究血細胞功能的重要方法,通過對血細胞內特定物質含量的檢測, 可推斷其在機體內行使的主要功能。

淋巴細胞是機體免疫系統的重要組成部分, 參與機體的細胞免疫和體液免疫。本研究顯示, 團頭魴淋巴細胞呈PAS及AS-DCE弱陽性, 呈ANAE陽性, 呈SBB、ACP、AKP及POX陰性。與其他魚類相一致的是, 花斑裸鯉[7]、胭脂魚[18]等淋巴細胞都為PAS及ANAE陽性反應; 而與其他魚類不同的是,大部分魚類的淋巴細胞都具有ACP陽性反應, 如齊口裂腹魚[1]、鋸蓋魚[8]、墨瑞鱈(Maccullochella peelii peelii)[21]、長吻(Leiocassis longirostrisGünther)[22]等。PAS和SBB染色可分別顯示細胞內糖原和脂類物質, 糖原與脂類物質都可為細胞生命活動提供能量[21]; 團頭魴淋巴細胞呈PAS弱陽性表明細胞內有一定的糖原積累, 可為細胞的代謝活動提供能量, 而呈SBB陰性表明細胞內不含脂質, 無法通過脂代謝來提供能量。ANAE是存在于溶酶體初級顆粒中的一種非特異性酯酶, 在細胞吞噬作用和抗原呈遞過程中發揮重要作用[1]。AS-DCE是一種特異性酯酶, 亦與吞噬作用有關[21]。ACP、AKP和POX則是參與細胞吞噬和殺菌作用的重要酶類[21]。團頭魴淋巴細胞呈AS-DCE弱陽性, 呈ANAE陽性, 呈ACP、AKP和POX陰性, 表明淋巴細胞可能不具有吞噬作用及殺菌能力, 而可能會行使一定的抗原呈遞功能。

單核細胞具有吞噬殺菌能力, 在體內非特異性免疫過程中扮演重要角色。在團頭魴中, 單核細胞呈PAS、SBB、AS-DCE以及ANAE陽性, ACP、POX強陽性, 呈AKP陰性。在齊口裂腹魚[1]、花斑裸鯉[7]中, 單核細胞呈PAS、ACP、POX及ANAE陽性, 與團頭魴的結果基本一致, 而在胭脂魚[18]及長吻[22]中只有PAS、ACP及ANAE呈陽性, SBB及POX呈陰性反應。團頭魴單核細胞呈PAS和SBB陽性表明胞內具有較多的能源物質積累, 可為細胞生命活動提供充足能量; 呈ANAE陽性表明單核細胞具有抗原呈遞功能; 呈AS-DCE、ACP及POX陽性則表明該細胞具有較強的吞噬殺菌能力。

嗜中性粒細胞在體內主要與吞噬作用有關, 團頭魴嗜中性粒細胞呈PAS和AS-DCE弱陽性,SBB和ANAE陽性, POX和ACP強陽性, 呈AKP陰性。在長吻[22]中, 嗜中性粒細胞呈PAS、SBB、ACP、POX及ANAE陽性, 呈AKP陰性, 與團頭魴的結果大體一致; 在花斑裸鯉[7]及齊口裂腹魚[1]中, 嗜中性粒細胞呈PAS、ACP、POX及ANAE陽性, 但呈SBB陰性, 這與團頭魴的結果略有不同。團頭魴嗜中性粒細胞與單核細胞染色結果相似, 表明嗜中性粒細胞在功能上和單核細胞類似, 參與體內的抗原遞呈和吞噬殺菌等免疫防御過程。

嗜酸性粒細胞通常在與寄生蟲感染相關的免疫防御過程中起吞噬異物的作用。在團頭魴中, 嗜酸性粒細胞呈PAS、AS-DCE弱陽性, SBB、ACP陽性, ANAE及POX強陽性, 呈AKP陰性。在花斑裸鯉[7]中, 嗜酸性粒細胞僅為PAS、ACP及ANAE陽性, 與團頭魴染色結果差異較大, 嗜酸性粒細胞的化學特征在其他大部分魚類中都未見報道。團頭魴嗜酸性粒細胞染色結果與單核細胞及嗜中性粒細胞相似, 呈PAS、SBB陽性, 表明嗜酸性粒細胞含有豐富的能源物質; 呈ACP陽性、ANAE及POX強陽性, 表明嗜酸性粒細胞具有吞噬作用及較強的殺菌功能。

血栓細胞在機體內主要行使凝血的功能, 但在某些魚類中發現血栓細胞也具有吞噬作用[4]。團頭魴血栓細胞呈PAS、AS-DCE及ANAE弱陽性, 呈SBB、ACP、AKP及POX陰性。與其他魚類相一致的是, 一些魚類如花斑裸鯉[7]、鋸蓋魚[8]和胭脂魚[18]等血栓細胞亦呈PAS和ANAE陽性; 而與其他魚類不同的是, 大部分魚類如鋸蓋魚[8]、胭脂魚[18]、齊口裂腹魚[1]和長吻[22]等血栓細胞呈ACP陽性。團頭魴血栓細胞內不含有ACP和POX, 表明血栓細胞不具有吞噬和殺菌能力, 呈ANAE陽性則表明其可能具有呈遞抗原的功能。

總之, 團頭魴外周血細胞的種類、顯微結構和細胞化學特征與其他魚類有相似之處, 也有其明顯的物種特異性, 如團頭魴外周血細胞大小存在顯著的性別差異; 團頭魴外周血中未見嗜堿性粒細胞,存在多種形態的血栓細胞; 團頭魴淋巴細胞和血栓細胞呈ACP陰性, 而其他大多數魚類白細胞和血栓細胞均呈ACP陽性; 團頭魴單核細胞和粒細胞呈SBB陽性, 而其他大多數魚類白細胞均為SBB陰性或只有中性粒細胞呈SBB陽性。本研究增進了對團頭魴外周血細胞結構和功能的認識, 為團頭魴的健康監測和病理診斷提供了基礎資料。值得說明的是, 本實驗檢測所用鮮活團頭魴購自于農貿市場,可能處于應激狀態, 因而本研究結果是否與正常生活狀態相符有待進一步確證。