EDNRB基因真核表達載體的構建及其對MCF-7細胞增殖的影響

劉立琨 劉得水 李新 岳麗玲 林悅銘 張微 周麗

[摘要] 目的 構建pCI2-EDNRB真核表達載體，探討EDNRB過表達對MCF-7細胞增殖的影響。 方法 設計EDNRB基因特異性引物，應用PCR法擴增其編碼序列，構建pCI2-EDNRB真核表達載體并轉染MCF-7細胞，RT-PCR和Western blot分別檢測EDNRB的mRNA和蛋白表達;MTT法檢測EDNRB過表達后MCF-7細胞增殖能力。結果pCI2-EDNRB真核表達載體成功構建，MCF-7細胞中EDNRB的mRNA和蛋白水平均較對照組明顯升高，過表達EDNRB抑制了MCF-7細胞的增殖。 結論 該研究成功構建了pCI2-EDNRB真核表達載體，過表達EDNRB可抑制MCF-7細胞增殖，這為深入研究EDNRB在乳腺癌中的功能及分子機制打下良好基礎。

[關鍵詞] 內皮素受體B;真核表達;MCF-7細胞;細胞增殖

[中圖分類號] R736? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-0742（2020）01（b）-0026-03

Construction of EDNRB Gene Eukaryotic Expression Vector and Its Effect on Proliferation of MCF-7 Cells

LIU Li-kun1， LIU De-shui1， LI Xin2， YUE Li-ling1， LIN Yue-ming3， ZHANG Wei1， ZHOU Li1

1.Qiqihar Medical Institute of Pharmaceutical Sciences ，Qiqihar， Heilongjiang Province，161006? China; 2.Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical College Breast Surgery，Qiqihar， Heilongjiang Province，161000? China; 3.Medical Technology School， Qiqihar Medical College， Qiqihar， Heilongjiang Province， 161006? China

[Abstract] Objective To construct the eukaryotic expression vector pCI2-EDNRB and investigate the effect of EDNRB overexpression on the proliferation of MCF-7 cells. Methods EDNRB gene-specific primers were designed and amplified by PCR. The eukaryotic expression vector pCI2-EDNRB was constructed and transfected into MCF-7 cells. The mRNA and protein expression of EDNRB were detected by RT-PCR and Western blot， respectively. MTT assay The proliferation ability of MCF-7 cells after over-expression of EDNRB was examined. Results The eukaryotic expression vector of pCI2-EDNRB was successfully constructed. The mRNA and protein levels of EDNRB in MCF-7 cells were significantly higher than those in the control group. Overexpression of EDNRB inhibited the proliferation of MCF-7 cells. Conclusion The eukaryotic expression vector pCI2-EDNRB was successfully constructed in this study. Overexpression of EDNRB can inhibit the proliferation of MCF-7 cells， which lays a good foundation for further study of the function and molecular mechanism of EDNRB in breast cancer.

[Key words] Endothelin receptor B; Eukaryotic expression; MCF-7 cells; Cell proliferation

乳腺癌是一種異質性很強的惡性腫瘤，不同分子亞型的乳腺癌都有其自身的發生發展規律、生物學特點及預后風險。因此，尋找更具潛力的精準的分子靶標對于乳腺癌的治療顯得尤為重要。內皮素受體B（endothelin receptor B，EDNRB）是G蛋白偶聯受體A家族成員，已有研究表明其在多種惡性腫瘤中異常表達，參與腫瘤的發生發展[1-4]。該研究擬構建EDNRB真核表達載體，并驗證其對MCF-7細胞增殖的影響，為進一步研究EDNRB在乳腺癌發生發展中的功能和機制研究打下基礎。

1? 資料與方法

1.1? 材料

人乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7購自中科院上海細胞庫;MEM培養基購自Gibco公司;L-15培養基購自美國Hyclone公司;ExTaq DNA聚合酶、膠回收試劑盒、限制性內切酶KpnI、Sal I及T4 DNA連接酶購自Takara公司;反轉錄試劑盒、DH5α感受態細胞購自全式金公司;TRIzol、OPTI-MEM、LipofectaminTM3000脂質體轉染試劑盒購自Invitrogen公司;真核表達載體pCI2由齊齊哈爾醫學院蛋白質結構與功能研究室惠贈。

1.2? 方法

1.2.1? 細胞培養MDA-MB-231細胞于含10%胎牛血清的L15培養基、37℃、無CO2的飽和濕度下培養，MCF-7細胞培養在含10μg/mL胰島素、10%胎牛血清和1%的雙抗（100 U/mL青霉素，100 mg/L鏈霉素）的MEM培養基中、于37℃、5% CO2條件下培養。

1.2.2? pCI2-EDNRB真核表達載體的構建從GeneBank中獲取人EDNRB基因序列（NM_000115.4），借助Primer5.0軟件設計基因特異性引物，上游和下游分別引入Kpn I和Sal I酶切位點。EDNRB上游引物：5'-CGGGGTACCATGCAGCCGCCTCCAAGTCT-3'，下游引物：5'-ACGCGTCGACCTTCTTTCAAGATGAGCTGTATT-3'。TRIzol法提取MDA-MB-231細胞中總RNA，反轉錄合成cDNA，PCR擴增EDNRB基因全長序列。Kpn I/Sal I內切酶對PCI2載體和EDNRB擴增產物雙酶切，純化連接后，轉化感受態細胞DH5α，挑取陽性克隆進行酶切和測序鑒定。

1.2.3? 重組質粒pCI2-EDNRB瞬時轉染? MCF-7細胞取對數生長期的MCF-7細胞，5×105/mL密度接種到6孔板，待細胞匯合度達到80%，按LipofectamineTM 3 000轉染試劑盒說明書進行轉染，轉染空載體PCI2作為對照，24 h后提取各組細胞的RNA和蛋白進行mRNA和蛋白水平的鑒定。

1.2.4? RT-PCR檢測 EDNRB mRNA水平的表達TRIzol法提取細胞總RNA進行RT-PCR，β-actin作為參照。EDNRB上游引物：5′-ACAAAGGAAGTT TCTGCGAATC-3′，下游引物：5′- CAGCAGAGGGCAAAGACAAG-3′;β-actin上游引物：5′-CGTGCGTGACATTAGGAGAG 3′，下游引物：5′-GGAAGGAAGGCTG

GAAGAGTG-3′。反應條件：42℃逆轉錄30min;95℃變性30 s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環;72度延伸7 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。

1.2.5? Western blot檢測 EDNRB蛋白水平的表達重組質粒pCI2-EDNRB轉染MCF-7細胞24 h后收集各組細胞，RIPA裂解后提取細胞總蛋白。SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉37℃封閉2 h。人兔抗EDNRB一抗4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10min后，羊抗兔IgG-HRP二抗室溫孵育2 h，ECL顯影。以GAPDH作為內參，Image Lab軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.6? MTT檢測細胞增殖將生長良好的MCF-7細胞接種于96孔板，每孔5×103個細胞。細胞融合率達到80%，轉染細胞，連續培養3 d，每天每組取3個平行孔細胞，加入MTT溶液（20 μL/孔），37℃孵育4 h后，每孔加入150 μL DMSO，于490 nm處檢測每孔吸光值，以時間為橫坐標，OD490 nm值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.3? 統計方法

應用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析， 計量資料用（x±s）表示，組間比較行t檢驗，計數資料用[n（%）]表示，組間比較行χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1? 成功構建pCI2-EDNRB重組質粒

以MDA-MB-231細胞的cDNA為模板，PCR擴增EDNRB基因的編碼區，結果顯示在大約1 300 bp處有特異性擴增條帶，片段大小與預期產物（1 329 bp）大小相符（圖1A）。將重組質粒進行酶切鑒定，獲得長約4 000 bp和1 300 bp的兩條片段，符合預期結果。將陽性克隆進行測序，經NCBI BLAST比對，顯示序列完全正確，說明pCI2-EDNRB表達載體成功構建（圖1B）。

A. PCR擴增產物，M：DL2 000 DNA marker;1：EDNRB基因PCR產物。B. pCI2-EDNRB重組質粒雙酶切鑒定，M：DL10 000 DNA marker;1：pCI2質粒;2：pCI2-EDNRB重組質粒;3：pCI2-EDNRB雙酶切產物。

2.2? pCI2-EDNRB轉染MCF-7細胞EDNRB的mRNA和蛋白水平上調

為了驗證EDNRB能否在MCF-7細胞中正確轉錄，半定量RT-PCR檢測EDNRB的mRNA表達。結果顯示：與對照組相比，實驗組中EDNRB的mRNA表達明顯上調（圖2A）。為了驗證EDNRB能否在MCF-7細胞中正確翻譯，以GAPDH為內參進行Western blot檢測。結果顯示，對照組EDNRB蛋白表達較弱，相對灰度值為0.195;而pCI2-EDNRB轉染組中EDNRB蛋白表達明顯增強，相對灰度值為0.810，兩組間差異有統計學意義（P<0.01）。

A. RT-PCR檢測EDNRB的mRNA表達，β-actin作為對照，M：DL2000 DNA marker;1：對照組;2：實驗組。B. Western blot檢測EDNRB的蛋白表達，GAPDH作為對照，1：對照組;2：實驗組

2.3? EDNRB過表達抑制了MCF-7細胞增殖

用Lipofectamine 300 0介導pCI2-EDNRB重組質粒轉染MCF-7細胞，分別于轉染后0、24、48和72 h加入MTT檢測。如圖3所示，與對照組相比，pCI2-EDNRB轉染可明顯抑制乳腺癌細胞MCF-7的增殖，且隨著時間延長，其抑制作用增強。

3? 討論

乳腺癌是一種來源于上皮細胞的惡性腫瘤[5]，其組織細胞具有高度異質性[6]，部分腫瘤容易發生耐藥、復發和轉移，目前在女性癌癥相關死亡率高發位居第2位[7]。根據2015年St. Gallen會議提出的臨床病理替代分子分型，將乳腺癌分為管腔A型（Luminal A type）、管腔B型（Luminal B type）、HER2過表達型（HER2-enriched type）及三陰性乳腺癌（Basal-like or triple-negative breast cancer，TNBC）等4種分子亞型[8]。后兩種亞型預后較差，尤其是TNBC，預后最差。因此，對于不同分型和組織學分級的乳腺癌診治及預后仍需要精準的分子靶標。

越來越多的研究指出EDNRB在許多人類惡性腫瘤中呈現低表達狀態，參與癌癥的發生發展進程。Zhou等[1]發現EDNRB在鼻咽癌組織及鼻咽癌細胞系中的表達較對照組明顯下調。吳川清等[2]發現EDNRB在胃癌SGC-7901細胞中因高甲基化而表達缺失，5-Aza-CdR誘導EDNRB重新表達后抑制了SGC-7901細胞的增殖。牟童等[3]發現EDNRB在肝癌組織和SMMC-7721、Huh7細胞中表達均低于對照組，EDNRB過表達抑制了SMMC-7721和Huh7細胞的侵襲和遷移。劉立琨等[4]發現EDNRB在乳腺癌MCF-7和ZR-75-1細胞中因啟動子區CpG島高甲基化而表達缺失。這些結果均提示，EDNRB異常表達與癌癥的發生發展進程密切相關，其有望成為癌癥診治與預后的新靶點分子，但其如何調控癌癥的發生發展進程尚未見文獻報道。

綜上所述，該研究選取乳腺癌細胞作為實驗模型，通過重組DNA技術構建了真核表達載體pCI2-EDNRB，經酶切和測序鑒定后轉染MCF-7細胞，RT-PCR和Western blot結果證實EDNRB的mRNA和蛋白表達均較對照組高表達，進一步的功能研究顯示過表達EDNRB的MCF-7細胞的增殖能力明顯受到抑制。因此，該文推測EDNRB在乳腺癌中具有抑癌作用。這為進一步研究EDNRB在乳腺癌發生發展中的作用及分子機制提供理論支持。

[參考文獻]

[1]? Zhou L， Feng X， Shan W， et al. Epigenetic and genetic alterations of EDNRB gene in nasopharyngeal carcinoma[J].Oncology， 2007，72（5-6）：357-363.

[2]? 吳川清， 韓高雄， 帥曉明， 等. 5-氮雜-2-脫氧胞苷對人胃癌SGC-7901細胞株生長及EDNRB基因啟動子異常甲基化的影響[J].世界華人消化雜志， 2010，18（36）：3843-3847.

[3]? 牟童.肝細胞癌中關鍵基因與microRNA的交互作用分析及EDNRB基因對肝癌細胞的作用研究[D].重慶：重慶醫科大學，2017.

[4]? 劉立琨，朱文斌，劉得水，等.4株乳腺癌細胞中內皮素受體B基因的甲基化狀態及對MCF-7細胞增殖的影響 [J].解剖學報，2018，49（5）： 611-616.

[5]? 陳琛，謝長寬，馮江濤.乳腺癌腫瘤標志物在分子診斷中的作用 [J].世界最新醫學信息文摘，2018，18（68）：109-110.

[6]? Oltmann J， Heselmeyer-haddad K， Hernandez LS， et al. Aneuploidy， TP53 mutation， and amplification of MYC correlate with increased intratumor heterogeneity and poor prognosis of breast cancer patients[J].Gene Chromosome Canc， 2018， 57（4）：165-175.

[7]? Siegel RL， Miller KD， Jemal A. Cancer statistics， 2017[J]. CA-cancer J Clin， 2017，67（1）：7-30.

[8]? 邵志敏， 李俊杰. 2015年St.Gallen國際乳腺癌研討會乳腺癌新的診療理念[J]. 中華乳腺病雜志：電子版，2015，9（2）：73-77.

（收稿日期：2019-10-22）

[基金項目] 黑龍江省教育廳科學技術研究項目（2016-KYYWF-0863）

[作者簡介] 劉立琨（1982-），女，黑龍江雙城人，博士，助理研究員，研究方向：腫瘤發生分子機制。