子二代中華鱘對急性低溫脅迫的生理響應

管 敏，張德志，王 龍，班文波，張厚本，郭柏福，姜 偉

( 中國長江三峽集團有限公司 中華鱘研究所，三峽工程魚類資源保護湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443100 )

中華鱘(Acipensersinensis)為大型溯河產卵洄游性魚類，屬國家一級重點保護動物。作為變溫動物，水溫是影響中華鱘正常生長和代謝的重要環境因子之一。中華鱘的最適生長溫度為14～23 ℃[1]，在其生活環境中，經常出現由季節更替、氣候變化及人為因素等導致水溫出現節律性或突發性的溫度降低[2]，從而對其造成一定程度的低溫脅迫。低溫脅迫可以對魚類的行為[3]、營養代謝[4]、血液指標[5-6]、抗氧化能力[7]、免疫[8-9]、消化能力[5]等產生影響。當低溫脅迫的強度在魚體耐受范圍內時，機體會通過自我調節適應低溫環境；當低溫脅迫的強度超出魚類承受能力時，魚體內環境穩態將發生不可逆的改變，最終導致其死亡[10]。因此，研究急性低溫脅迫對子二代中華鱘的影響對其物種保護具有非常重要的實際意義。

在中華鱘物種保護研究方面，國內學者做了大量工作。1983年，野生中華鱘的人工繁殖技術獲得突破，并形成一定數量的子一代中華鱘群體[11]，并于2009年獲得初具數量規模的子二代中華鱘群體[12]。子二代中華鱘與子一代存在較明顯的種質差異，主要表現為生長慢[13]、抗逆性差和遺傳多樣性丟失[14]等。這與繁殖親本不同性質的生活環境有關，子一代中華鱘親本與野生親本相比，其生存于純淡水養殖環境中，無法進行江海洄游，缺少在海洋中生長育肥的階段[13]。目前，環境脅迫對中華鱘影響研究的對象均為子一代中華鱘，主要集中在饑餓脅迫[15]、擁擠脅迫[15]、漸變溫度脅迫[16-18]、氨氮和亞硝態氮的急性脅迫[19]等方面，而關于急性低溫脅迫對子二代中華鱘抗氧化、免疫及消化能力影響的研究未見報道。筆者通過對子二代中華鱘進行急性低溫脅迫，探究其抗氧化指標、免疫指標及消化酶活性對急性低溫脅迫的響應，以期為子二代中華鱘的人工養殖、運輸和放流提供重要的技術依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗魚為中國長江三峽集團公司中華鱘研究所2014年全人工繁殖所得的子二代中華鱘。隨機挑選規格一致、體質健康的子二代中華鱘27尾[體質量(1.72±0.33) kg，全長(74.40±5.80) cm]，并將其暫養于直徑4.0 m的養殖池中，暫養水體溫度23.0 ℃、溶解氧6.0～7.0 mg/L、pH 7.3～7.6、氨氮0.01 mg/L、亞硝態氮0.005 mg/L。每日飽食投喂1次(投喂量為魚體質量1%)，暫養3 d后開始試驗，試驗開始前1 d停止投喂。

1.2 試驗設計

試驗在3個直徑4.0 m、水深0.8 m的試驗池中進行，試驗池水溫分別設置為23、17 ℃和11 ℃，其中，23 ℃組為常溫對照組，17 ℃組和11 ℃組為低溫脅迫組，每個溫度組9尾魚，設3個平行對照組。具體試驗方法為：使用循環水系統的制冷機將試驗池中的水溫由23.0 ℃降至設定溫度后，將試驗魚由23 ℃暫養水體中分別直接轉至水溫為17 ℃和11 ℃的試驗池中，低溫脅迫2 h后取樣；23 ℃組作為常溫對照組，也采取相同的人為操作方法將試驗魚由23 ℃暫養池中轉至水溫為23 ℃的試驗池中，2 h后取樣。在整個轉魚過程中，為了最大限度減少人為操作對試驗魚造成的應激反應，試驗魚的轉移采用轉運箱帶水轉移的方法。試驗期間連續充氣，每30 min校調一次溫度，維持溫差在±0.5 ℃。

1.3 樣品采集和處理

采集27尾子二代中華鱘血液、肝臟、胃及腸道樣品；每尾魚取25～35 mL血液，采集18份肝臟組織、6份胃組織和6份腸道組織樣品。取樣前，用120 mg/L MS-222將魚進行麻醉，然后抽血，離心后將上層血清分裝于2 mL離心管中，經液氮快速冷凍后，-70 ℃保存待測。將試驗魚解剖，取肝臟、胃和腸道并經預冷的0.65%的生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水后，切成約0.5 g的組織塊，取3～4個組織塊裝于2 mL離心管中，每個離心管為1份樣品，經液氮快速冷凍后，-70 ℃保存待測。

1.4 指標測定

抗氧化指標包括超氧化物歧化酶活性、過氧化氫酶活性、總抗氧化能力活性、谷胱甘肽含量、丙二醛含量；免疫指標包括溶菌酶活性和免疫球蛋白M含量；消化酶指標包括淀粉酶、脂肪酶、胃蛋白酶。所有指標的測定采用南京建成生物工程研究所研制的試劑盒。

1.5 數據統計

數據用SPSS 16.0和Excel 2016軟件進行統計分析，利用單因素方差分析和Duncan′s多重比較檢驗低溫脅迫對各項指標影響的顯著性，以P<0.05為差異顯著，結果以平均值±標準差表示。

2 結 果

2.1 急性低溫脅迫對子二代中華鱘抗氧化指標的影響

急性低溫脅迫2 h，雖未導致子二代中華鱘直接死亡，但對其抗氧化指標已產生顯著影響(表1)。子二代中華鱘血清超氧化物歧化酶活性隨水溫驟降溫差的增大呈先升后降的趨勢，11 ℃組和17 ℃組差異顯著(P<0.05)；血清過氧化氫酶活性顯著降低(P<0.05)；血清總抗氧化能力活性顯著增加，23 ℃組與17、11 ℃組差異顯著(P<0.05)；各溫度組血清谷胱甘肽和丙二醛含量均為11 ℃組>23 ℃組>17 ℃組(P>0.05)。

表1 急性低溫脅迫對子二代中華鱘血清抗氧化指標的影響

注：不同字母表示不同溫度組之間差異顯著(P<0.05)，下同.

子二代中華鱘肝臟超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和總抗氧化能力活性隨水溫驟降溫差的增大呈先升后降的趨勢(表2)。其中，11 ℃組肝臟超氧化物歧化酶活性與17、23 ℃組差異顯著(P<0.05)，17 ℃組肝臟過氧化氫酶活性與11、23 ℃組均差異顯著(P<0.05)，各組肝臟總抗氧化能力活性差異不顯著(P>0.05)；肝臟谷胱甘肽含量顯著下降(P<0.05)，而肝臟丙二醛含量顯著增加(P<0.05)。

2.2 急性低溫脅迫對子二代中華鱘免疫指標的影響

隨著水溫驟降幅度的增大，血清和肝臟溶菌酶活性均呈先升后降的趨勢(圖1)，其中，各溫度組血清溶菌酶活性差異顯著(P<0.05)，17 ℃組肝臟溶菌酶活性顯著高于11 ℃組和23 ℃組(P<0.05)。

表2 急性低溫脅迫對子二代中華鱘肝臟抗氧化指標的影響

隨著水溫驟降溫差的增大，子二代中華鱘血清和肝臟的免疫球蛋白M含量均呈逐漸遞減的趨勢，但各組間差異不顯著(P>0.05)(圖2)。

2.3 急性低溫脅迫對子二代中華鱘消化酶活性的影響

急性低溫脅迫2 h，對子二代中華鱘消化酶活性產生顯著影響。隨著水溫驟降溫差的增大，子二代中華鱘胃淀粉酶、腸淀粉酶和肝臟淀粉酶活性持續下降(圖3)，且23 ℃組胃淀粉酶、腸淀粉酶和肝臟淀粉酶活性與11 ℃組均差異顯著(P<0.05)。在同一水溫組中，腸淀粉酶活性顯著低于胃淀粉酶和肝臟淀粉酶活性(P<0.05)。

圖1 急性低溫脅迫對子二代中華鱘血清和肝臟溶菌酶活性的影響不同字母代表中不同溫度組之間差異顯著(P<0.05),下同.圖2 急性低溫脅迫對子二代中華鱘血清和肝臟免疫球蛋白M含量的影響

圖3 急性低溫脅迫對子二代中華鱘淀粉酶活性的影響不同小寫字母表示相同組織不同溫度組之間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示相同溫度不同組織之間差異顯著(P<0.05)，下同.

子二代中華鱘肝臟脂肪酶活性顯著高于胃、腸(P<0.05)(圖4)。水溫驟降顯著提高胃和肝臟的脂肪酶活性(P<0.05)，但對腸脂肪酶活性影響不顯著(P>0.05)。

圖4 急性低溫脅迫對子二代中華鱘脂肪酶活性的影響

子二代中華鱘胃組織的胃蛋白酶活性顯著高于腸道和肝臟(P<0.05)(圖5)。由此可見，在比較急性低溫脅迫對魚體胃蛋白酶活性影響時，可忽略肝臟和腸道中的胃蛋白酶，直接選用胃組織中胃蛋白酶的活性變化來代表魚體胃蛋白酶的活性變化。本試驗中，水溫驟降2 h顯著降低了魚體胃蛋白酶的活性(P<0.05)，且胃蛋白酶的活性隨水溫驟降幅度的增大呈先降后升的趨勢(P<0.05)，但11 ℃組胃蛋白酶活性仍顯著低于23 ℃組(P<0.05)。

圖5 急性低溫脅迫對子二代中華鱘胃蛋白酶活性的影響

3 討 論

3.1 急性低溫脅迫對子二代中華鱘抗氧化能力指標的影響

生物體內存在可清除過多活性氧自由基的抗氧化防御體系，主要包括抗氧化酶系統和非酶促系統，其中，超氧化物歧化酶和過氧化氫酶就是抗氧化防御體系中非常重要的功能酶[20]，二者相互關聯，可聯合清除活性氧自由基，其活性的下降標志著機體清除活性氧自由基的能力下降[21]。本研究中，隨著水溫驟降溫差的增大，子二代中華鱘血清、肝臟的超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性均出現先升后降的趨勢，這與銀鯧(Pampusargenteus)幼魚[22]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)幼魚[23]的研究結果相同。這表明，當水溫由23 ℃驟降至17 ℃時，魚體可以通過提高超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性來應對低溫應激反應的影響；但當驟降溫差增至12 ℃時，11 ℃組血清和肝臟的超氧化物歧化酶活性顯著低于17 ℃組，說明12 ℃的驟降溫差已對魚體內抗氧化酶活性產生顯著的抑制作用，而劉奇奇[24]分析認為，這不僅與酶活力下降有關，還與溫度驟降導致酶合成途徑受阻有關。

谷胱甘肽是一種低分子活性氧自由基清除劑[25]，是清除活性氧自由基非常重要的非酶抗氧化物質[26]。本試驗中，子二代中華鱘肝臟谷胱甘肽含量隨水溫驟降溫差的增大呈先降后升的趨勢，這與超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性變化趨勢相反，推測其原因為谷胱甘肽是谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽轉移酶分解過氧化氫所必需的底物[26]，水溫驟降直接影響谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽轉移酶活性，從而間接影響谷胱甘肽的含量。銀鯧幼魚[22]的研究結果證實了這一推測，當溫度自27 ℃驟降至22 ℃時，銀鯧幼魚肝臟谷胱甘肽過氧化物酶活性在0～12 h內顯著下降。

總抗氧化能力的大小是衡量機體抗氧化系統功能的綜合性指標，它可以反映機體抗氧化防御系統應對外來脅迫的能力[27]。馮廣朋等[17]研究發現，在水溫恒定的條件下，20 ℃組子一代中華鱘幼魚總抗氧化能力活性高于15 ℃組、25 ℃組和30 ℃組，分析認為，由于魚類在低溫和高溫條件下，機體內活性氧自由基增多導致防御體系的抗氧化物質不斷減少引起的。本研究中，水溫驟降顯著增加子二代中華鱘血清總抗氧化能力活性，說明魚體針對低溫脅迫已開啟自我保護機制；11 ℃組中血清總抗氧化能力顯著高于23 ℃組(P<0.05)，這可能是因為當魚體抗氧化酶促反應體系受抑制時，非酶促反應體系(如氨基酸、維生素、金屬蛋白質等)應對應激反應的的結果。此外，11 ℃組肝臟總抗氧化能力含量與其他兩組相比不升反降，這與四指馬鲅(Eleutheronematetradactylum)幼魚[24]在水溫驟降12 ℃脅迫2 h時的結果相同。

丙二醛是活性氧自由基與脂質發生過氧化反應的產物，它可以反映細胞受活性氧自由基攻擊的程度，從而間接反映機體抗氧化能力的強弱及組織細胞受損傷的嚴重程度[22,25]。試驗結果表明，子二代中華鱘血清丙二醛含量隨水溫驟降幅度的增大呈先降后升的趨勢，但各組之間差異不顯著(P>0.05)；而肝臟丙二醛含量隨驟降溫差的增大而急劇增加(P<0.05)，分析認為急性低溫脅迫造成魚體產生大量活性氧自由基，抗氧化系統在短時間內無法清除過量的活性氧自由基，使得活性氧自由基不斷攻擊肝臟細胞產生大量丙二醛，這間接反映了急性低溫脅迫對子二代中華鱘的肝臟造成了一定程度的損傷。這與四指馬鲅幼魚的研究結果相同[24]，即當水溫由27 ℃驟降至15 ℃并脅迫2 h時，其肝臟已受到較為嚴重的損傷，具體表現為肝細胞空泡化、肝板結構混亂、肝血竇間隙收縮及肝細胞整體染色加深。

3.2 急性低溫脅迫對子二代中華鱘免疫指標的影響

溶菌酶是魚體非常重要的免疫因子，其活性與水溫、鹽度、細菌等環境因子密切相關[28]。在急性應激條件下，魚體血清中溶菌酶活性會顯著增加[29]。本研究中，子二代中華鱘血清、肝臟的溶菌酶活性隨水溫驟降幅度增大均呈先升后降的趨勢，即當水溫由23 ℃驟降至17 ℃時，子二代中華鱘血清、肝臟溶菌酶活性增加，說明魚體通過提高溶菌酶活性來增強自身非特異免疫的能力，以應對低溫驟降帶來的不利影響，這與孫學亮等[30]的報道結果類似；但當水溫由23 ℃驟降至11 ℃時，血清、肝臟溶菌酶活性與17 ℃組相比顯著下降，這表明，溫差達12 ℃顯著降低了魚體溶菌酶活性，對機體的免疫功能產生了顯著的抑制作用。這與Fevolden等[31]認為的脅迫強度和方法可以影響溶菌酶活性變化的觀點一致。

免疫球蛋白M是魚體內一種重要的免疫球蛋白[29]，其含量的多少是評價魚體免疫應答反應的一項重要指標[22]。本研究中，子二代中華鱘血清和肝臟免疫球蛋白M含量隨水溫驟降溫差的增大均呈現遞減的趨勢(P>0.05)，這與低溫脅迫對銀鯧幼魚[22]、莫桑比克羅非魚(O.mossambicus)[29]的血清免疫球蛋白M影響結果基本相同，說明溫度的驟降抑制了免疫球蛋白M的產生，降低了魚體的免疫力。

3.3 急性低溫脅迫對子二代中華鱘消化酶活性的影響

魚類作為變溫動物，水溫驟變將直接影響其體內消化酶的活性[32]。研究發現，在一定溫度范圍內，溫度逐漸升高會增加奧尼羅非魚(O.niloticus×O.aureus)(22～34 ℃)[33]、鼠龍斑(Cromileptesaltivelis♀×Epinepheluslanceolatus♂)幼魚(26～33 ℃)[7]的消化酶活性，但溫度急降會對鼠龍斑的消化酶活性產生抑制作用[7]。本研究結果顯示，隨著水溫驟降溫差的增大，子二代中華鱘胃、腸和肝臟淀粉酶活性均不斷下降，這與賓石玉等[34]研究結果相一致，即低溫脅迫會顯著降低羅非魚體內淀粉酶的活性。試驗結果還表明，水溫驟降顯著提高了胃和肝臟的脂肪酶活性，其原因可能為魚體通過提高脂肪酶活性加速體內脂肪的降解，從而為魚體在短時間內提供更多能量以應對低溫脅迫帶來的不利影響，這與何杰等[29]的研究結論基本相符。

施兆鴻等[5]研究認為，急性低溫脅迫對銀鯧幼魚胃蛋白酶活性在48 h內無顯著影響，這與本試驗結果不同。本研究中，急性低溫脅迫顯著降低了魚體的胃蛋白酶活性，其原因可能為水溫驟降引起魚體消化系統的代謝強度降低，從而導致消化酶活性和基礎分泌量的降低，在神仙魚(Pterophyllumscalare)[35]和真鯛(Pagrosomusmajor)幼魚[36]的研究中得到類似的結果。研究結果還表明，11 ℃組的胃蛋白酶活性顯著高于17 ℃組，其原因可能為，當水溫驟降溫差為6 ℃時，魚體通過消耗糖原、脂肪等物質就可以滿足機體應對應激的能量需求，而當驟降溫差增至12 ℃時，消耗糖原、脂肪等物質已經不能滿足魚體需求，機體已經開始消耗部分蛋白質來加大能量供應。

研究發現，當水溫由27 ℃驟降至20 ℃和15 ℃，并脅迫2 h時，四指馬鲅幼魚的死亡率分別為23.33%和50%[24]。而本研究中，急性低溫脅迫2 h雖未導致子二代中華鱘直接死亡，但對其抗氧化、免疫和消化酶活性影響顯著。子二代中華鱘在水溫驟降時，試圖通過提高自身抗氧化能力消除體內過多的活性氧自由基，增強免疫能力以避免魚體受感染，并主動調節脂肪酶、蛋白酶等消化酶的活性為魚體應對脅迫提供必需的能量和物質，但過大的驟降溫差顯著抑制了魚體的抗氧化和免疫能力及消化酶活性，對肝臟組織也可能造成了一定程度的損傷。此外，建議在子二代中華鱘的運輸操作過程中，水溫驟降溫差應小于6 ℃，以避免其對魚產生不利影響。