休眠方式、溫度和時間對離水儲藏鯽魚生理指標的影響

曾 鵬，申 江，陳天及

( 1.上海海洋大學 食品學院，上海 201306； 2.天津商業大學 機械工程學院，天津 300134 )

活鮮魚在儲運過程中通常應用低溫，麻醉同充氧等方式提高存活率[1-2]。但是這些儲運手段中水的存在極大影響了運輸過程中的成本，因此水產品的無水儲運成為研究新方向[3]。冰溫技術通過低溫馴化增加了生物體的低溫耐受性，在冰溫條件下活體新陳代謝降低，魚類處于休眠狀態，從而達到無水運輸的目的[4-5]。低溫麻醉可以有效的對魚類進行麻醉，但會導致血液成分發生變化[6]。0～0.5 ℃被認為是大西洋鮭(Salmosalar)低溫休眠的溫度下限[7]。

丁香油有效成分為丁香酚，作為食品添加劑，在用作麻醉劑時不需要停藥期[8]。在鯉魚(Cyprinuscarpio)、大黃魚(Pseudosciaenacrocea)等魚類身上的試驗發現丁香油的半數致死質量濃度比三卡因甲磺酸鹽要高，比美國食品藥品監督管理局批準使用的麻醉劑三卡因甲磺酸鹽更安全[9]。丁香油在日本是可以使用的魚用麻醉劑，藥浴劑量為50～200 μg/L。鯽魚可以在37～80 mg/L丁香油質量濃度下有效麻醉，隨著質量濃度的增加，麻醉時間縮短，但復蘇時間延長[10]。

筆者通過比較丁香油麻醉和低溫誘導休眠對鯽魚(Carassiusauratus)生理的影響，及觀察離水后魚體在不同儲藏溫度和時間下的生理變化及應激反應，來討論休眠方式、溫度及時間對試驗魚離水后儲藏的影響。根據離水儲藏過程中鯽魚的生理變化，使用數據回歸分析法探討影響鯽魚復蘇的主要因素。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鯽魚采自天津地區某養魚池，選取健康成魚，體表鱗片完整，體質量(395.90±43.71) g。根據以往研究選取兩種休眠方式：由室溫(14 ℃)以1 ℃/h速率降溫至0 ℃誘導休眠；40 mg/L丁香酚浸浴2 min麻醉。

每組鯽魚100尾，分別以兩種休眠方式麻醉后，放置于聚乙烯周轉箱中，魚體下放置浸水吸水紙，以保持魚體濕潤，箱口遮蓋紙板，防止冷庫干耗。每種休眠方式組再隨機分為3組，分別放置于冰溫(0 ℃)儲藏及4、8 ℃控溫冷庫(溫度波動±0.2 ℃)中。自12 h起間隔12 h每組分別取出3尾取樣分析。

1.2 各組織取樣

血樣：心臟靜脈取血，使用肝素鈉小管采集樣品，低溫離心20 min(4 ℃，4000 r/min)，制備血清，-80 ℃超低溫冰箱保存待測。

肝胰臟及腦組織樣品：組織分離后，稱量質量后按1∶10加入50 mmol/L的磷酸鉀溶液(pH 7.0，包含0.5 mmol/L乙二胺四乙酸)研磨破碎，然后低溫離心20 min(4 ℃，4000 r/min)，取上清液離心30 min(4 ℃，12 000 r/min)，得去線粒體上清液及沉淀(線粒體)。-80 ℃超低溫冰箱保存待測。

1.3 測試與分析

所有測試在取樣后一周內進行，皮質醇、血糖、肝糖原及各項酶的測試均采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒進行，以P<0.05表示差異顯著，結果以平均值±標準差表示。使用SPSS 19.0軟件進行試驗數據的分析。以溫度和時間為自變量，進行雙因素方差分析，探究溫度、時間對血液生理指標的影響；由于離水后的儲藏是一個連續的變化過程，多類別邏輯有序回歸有助于克服使用單一結局作為因變量的不足。使用數據回歸分析法探討影響鯽魚復蘇的主要因素，對鯽魚離水儲藏后生存能力(以復蘇時間體現)作為自變量進行有序多分類回歸分析，以復水后恢復平衡的時間分組作為因變量。1組恢復平衡時間為0～5 min，2組恢復平衡時間5～20 min，3組恢復平衡時間20～30 min，4組30 min內不能恢復平衡。以各項生理指標、儲藏溫度、麻醉方式和離水時間作為自變量。其中誘導休眠的方式定義為分類變量：低溫休眠或丁香酚麻醉。

2 結 果

2.1 離水儲藏過程中試驗魚糖代謝指標變化

兩種休眠方式試驗組均觀察到，鯽魚肝糖原水平均隨儲藏時間延長而差異顯著(P<0.05，表現為其在離水儲藏過程中消耗的趨勢，圖1)。丁香酚麻醉組肝糖原受到儲藏溫度影響，0 ℃貯藏組最高(P<0.05)。

圖1 休眠方式、溫度及時間對鯽魚肝胰臟糖原含量的影響(n=3) 不同大寫字母表示同一溫度不同時間組差異顯著(P<0.05); 不同小寫字母表示同一時間不同溫度組差異顯著(P<0.05)，下同.

兩組離水儲藏過程中鯽魚血糖水平均無明顯變化(圖2)。試驗魚經丁香酚麻醉后其血清皮質醇含量在儲藏過程中無明顯變化，而低溫休眠魚體不同，其血清皮質醇水平隨儲藏溫度及儲藏時間變化差異顯著(P<0.05)，4 ℃儲藏組水平較高，60 h后數值達到最高(圖3)。

圖2 休眠方式、溫度及時間對鯽魚血糖濃度的影響(n=3)

圖3 休眠方式、溫度及時間對鯽魚血清皮質醇濃度的影響(n=3)

2.2 離水儲藏過程中試驗魚血清乳酸及腦丙二醛含量變化

低溫休眠組鯽魚血清乳酸水平受儲藏溫度影響顯著(P<0.05)，8 ℃儲藏條件下較高。試驗魚在丁香酚麻醉后同樣受儲藏溫度影響顯著(P<0.05)，8 ℃儲藏條件下血清乳酸水平較高,同時其數值受到儲藏時間影響，表現為先升后降的趨勢(圖4)。腦丙二醛水平在兩種方式誘導休眠后，均受儲藏溫度影響顯著(P<0.05)，其中8 ℃儲藏條件下較高(圖5)。

圖4 休眠方式、溫度及時間對鯽魚血清乳酸濃度的影響(n=3)

圖5 休眠方式、溫度及時間對鯽魚腦丙二醛含量的影響(n=3)

2.3 離水儲藏過程中試驗魚酶活力變化

兩組試驗魚肝胰臟過氧化氫酶活力均受儲藏溫度影響顯著(P<0.05)，較高的儲藏溫度(4、8 ℃)導致肝胰臟組織過氧化氫酶活力升高(圖6)。而低溫休眠組鯽魚肝胰臟過氧化氫酶活力也受到了儲藏時間的影響，在試驗開始時即12 h時最高，隨儲藏時間延長顯著降低(P<0.05)。

腦組織琥珀酸脫氫酶活力僅受儲藏時間影響顯著(P<0.05)，低溫休眠組腦組織琥珀酸脫氫酶活力在60 h達到最高值，同時丁香酚麻醉組腦組織琥珀酸脫氫酶活力在儲藏時間為48、60 h時較高(圖7)。

圖6 休眠方式、溫度及時間對鯽魚肝胰臟過氧化氫酶活力的影響(n=3)

圖7 休眠方式、溫度及時間對鯽魚腦琥珀酸脫氫酶活力的影響(n=3)

血清谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶受儲藏溫度及儲藏時間影響顯著(P<0.05)，兩者活力均隨儲藏時間延長及儲藏溫度升高而增加(圖8、圖9)。

2.4 數據回歸分析

平行線檢驗結果為P=0.88>0.05，滿足平行線假設，表明自變量可以應用有序邏輯回歸模型。各項參數與平衡時間的回歸模型見表1。其中儲藏時間、儲藏溫度、血清皮質醇及肝糖原與平衡時間相關,而休眠方式、血糖、血清乳酸、血清谷草轉氨酶谷草轉氨酶、腦丙二醛、腦琥珀酸脫氫酶與鯽魚離水儲藏后的復蘇時間無相關性。麻醉休眠方式對復蘇時間無明顯影響(P=0.86)，即采用低溫休眠和丁香酚麻醉后離水儲藏的鯽魚其復蘇時間無明顯區別。

圖8 休眠方式、溫度及時間對鯽魚血清谷丙轉氨酶活力的影響(n=3)

圖9 休眠方式、溫度及時間對鯽魚血清谷草轉氨酶活力的影響(n=3)

表1 休眠方式、溫度、時間及各項生理參數與平衡時間的有序回歸

3 討 論

3.1 麻醉及儲藏因素對生理機能的影響

對魚類脅迫反應的研究結果指出，皮質醇及血糖水平是反應魚體生理狀態的重要指標[11]。鯽魚血清皮質醇水平在低溫休眠組逐漸升高，而在丁香酚麻醉后離水儲藏過程中皮質醇水平無明顯變化。推測這是由于丁香酚能有效的緩解魚類應激狀態，有研究觀察到羅非魚(Oreochromis)在丁香酚麻醉中及麻醉后，其皮質醇含量明顯降低[12]。丁香酚可以降低大口黑鱸(Micropterussalmoides)運輸時的應激反應,在一定程度上降低大口黑鱸的生理生化變化,但長時間的運輸后,丁香酚并不能抑制運輸對魚體造成的傷害[13]。

運輸、低溫等條件脅迫下，魚體由于受到應激刺激導致內分泌系統中促兒茶酚胺和皮質醇的釋放[14]，進而影響糖類及脂類的儲備，尤其是肝糖原的儲備，以滿足機體快速代謝需求[15]。本研究在試驗過程中觀察到，脅迫過程中血糖無明顯變化，這同Dindia等[16]的研究結果一致。隨著鯽魚離水時間延長，肝糖原逐漸消耗，腦琥珀酸脫氫酶活力升高。這可能是由于在極端條件下，魚體通過調節不同代謝途徑的酶含量、轉換代謝途徑和改變組織細胞的分子組成等方式, 使魚體代謝和生理功能逐漸適應[17]。

溫度影響質膜的流動性，進而改變新陳代謝物質的運輸，同時調控多項應激介導的信號通路[18]。本研究顯示，較高的儲藏溫度導致腦丙二醛含量、乳酸含量及過氧化氫酶活力升高。丙二醛作為細胞膜氧化損傷的指示物，是脂質過氧化作用中衍生的代謝物[19]。離水操作脅迫后的紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)過氧化氫酶活力呈先升后降趨勢，丙二醛含量持續升高[20]。試驗中低溫休眠組鯽魚肝胰臟過氧化氫酶活力隨儲藏時間延長而降低，這可能因為魚體受外界刺激機體免疫機制受到刺激發揮作用,抗氧化酶活性升高，而當達到機體的耐受極限后,酶活力反而會被抑制[21]。

血清中酶活力的變化能夠反映機體代謝和物質轉化的狀況，以及組織結構功能的不同狀態，是機體組織細胞膜完整性的一個重要標志[22]。低溫脅迫下膜脂流動性和彈性減弱，膜脂的不對稱性增加，使得膜緊縮不均而造成膜的破損滲漏或通透性增加，胞內溶質外流入血液中[23]。谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶主要存在于肝胰臟細胞中，是肝胰臟損傷的重要指示酶。可能是由于離水儲藏中肝胰臟細胞造成損傷，從而使得肝胰臟中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶釋放到血液中，導致試驗鯽魚血清谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活力隨著儲藏時間延長及儲藏溫度升高而增加。

3.2 回歸結果分析

有序多分類回歸研究的因變量是有序的而且是多分類的,例如考察藥物對受試者作用，將效果區分為逐級遞進，由無效、有效直至治愈。優勢比為在其他條件不變的情況下，自變量每改變1個單位，事件發生比的變化率。優勢比等于1，表示該因素對事件的發生不起作用；優勢比大于1，表示該因素是危險因素；優勢比小于1，表示該因素是保護因素[24]。

儲藏溫度、肝糖原及儲藏時間的優勢比大于1，表明隨著儲藏溫度升高，儲藏時間延長，離水儲藏的鯽魚復蘇時間延長；肝糖原的含量較大，相應復蘇時間延長。血清皮質醇優勢比小于1，表明皮質醇含量高的鯽魚其復蘇時間較短。

各項參數的優勢比中，儲藏溫度影響較大，其值表示每升高1 ℃鯽魚復蘇時間延長一個等級的幾率增大1.42倍。儲藏時間的優勢比為1.09，其值表示儲藏時間延長1 h，鯽魚復蘇時間延長一個等級的幾率增大1.09倍。儲藏溫度儲藏時間作為危險因素，其數值的升高導致復蘇時間延長，即存活能力的下降。0 ℃儲藏較其他兩種儲藏溫度可以極大地提高鯽魚離水儲藏的存活能力。

肝糖原優勢比為1.02，其值表示肝糖原的數值增加一個單位，鯽魚復蘇時間延長一個等級的幾率增大1.02倍。皮質醇的結果顯示，皮質醇的數值增加一個單位，鯽魚復蘇時間延長一個等級的幾率變為0.83。皮質醇的水平升高同時肝胰臟糖原的消耗表明，鯽魚在離水儲藏過程需要維持一定的應激反應，同時減少生理功能的損傷，兩者的結果顯示，鯽魚正常生理功能的穩定有助于提高其離水后的存活能力。