黑曲霉超臨界萃取物抑制鏈格孢作用機(jī)制的初步研究

張素 袁洪威 李祝 肖洋 吉玉玉 唐婧紅

摘要本試驗(yàn)對(duì)黑曲霉菌絲體超臨界萃取物（SE）抑制鏈格孢的機(jī)制進(jìn)行了初步研究。采用超臨界萃取從黑曲霉菌絲體中獲得樣品SE，使用氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）對(duì)其萃取物進(jìn)行分離鑒定，并通過(guò)細(xì)胞膜滲透性測(cè)定、核酸和總蛋白含量測(cè)定、4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）熒光染色法、活性氧（ROS）含量測(cè)定、呼吸代謝途徑等方法對(duì)SE的抑菌機(jī)制進(jìn)行研究;電導(dǎo)率及核酸、蛋白結(jié)果顯示，SE能影響鏈格孢細(xì)胞膜的完整性，SE處理茵體4.5h，電導(dǎo)率比陰性對(duì)照增加了37.2%，胞外核酸蛋白含量顯著增加。DAPI染色結(jié)果顯示，DAPI可以和鏈格孢內(nèi)的核酸結(jié)合，經(jīng)SE作用30min，SE可引起細(xì)胞核染色質(zhì)異常彌散。ROS試驗(yàn)結(jié)果顯示，SE可以激發(fā)菌體產(chǎn)生過(guò)多的活性氧，SE作用鏈格孢40min時(shí)ROS含量比陰性對(duì)照增加了79.67%。呼吸代謝試驗(yàn)結(jié)果顯示，SE能抑制三羧酸循環(huán)（TCA）中的琥珀酸脫氫酶的活性，其抑制率為35.4%。SE具有較強(qiáng)的抑菌活性，其抑菌機(jī)制是通過(guò)影響細(xì)胞膜的正常功能、損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)和抑制真菌的呼吸代謝等方面實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞黑曲霉;超臨界萃取;鏈格孢;抑菌機(jī)制;琥珀酸脫氫酶;DAPI

中圖分類號(hào)：S482.292文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DoI：10.16688/j.zwbh.2018193

2.3SE對(duì)菌體細(xì)胞膜的影響

培養(yǎng)液電導(dǎo)率的改變可以反映細(xì)胞膜滲透性的改變。本研究的測(cè)定結(jié)果顯示，SE作用菌體初期，上清液電導(dǎo)率隨時(shí)問(wèn)的增加而增大。當(dāng)作用4.5h時(shí)，SE組電導(dǎo)率達(dá)到峰值，比陰性對(duì)照增加了37.2%（P<0.05）（圖3），說(shuō)明SE能影響鏈格孢細(xì)胞膜的通透性。有文獻(xiàn)報(bào)道可測(cè)定加藥前后DNA和RNA等大分子物質(zhì)的變化推測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞膜完整性的影響。為考慮SE影響鏈格孢細(xì)胞膜的通透性程度，測(cè)定了SE作用后菌體大分子物質(zhì)泄漏情況。如圖4所示，SE作用菌體初期核酸和蛋白質(zhì)含量明顯高于陰性對(duì)照組，雖然隨時(shí)問(wèn)推移呈逐漸下降趨勢(shì)，但差異依舊顯著（P<0.05）。以上兩個(gè)試驗(yàn)說(shuō)明，SE不僅引起鏈格孢細(xì)胞膜滲透性的改變，還可導(dǎo)致核酸和蛋白等大分子物質(zhì)外漏。

2.4SE對(duì)鏈格孢核酸含量的影響

DAPI是一種能夠與DNA和RNA結(jié)合的熒光染料，核酸量越大，熒光亮度越強(qiáng)。通過(guò)倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS IX73）觀察，DAPI可以穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，與核酸相結(jié)合。陰性對(duì)照與SE處理鏈格孢30min內(nèi)的熒光顯微鏡觀察結(jié)果見(jiàn)圖5。與陰性對(duì)照相比SE處理鏈格孢后該細(xì)胞核染色質(zhì)出現(xiàn)異常彌散，推測(cè)可能是SE導(dǎo)致的急性細(xì)胞核破碎，隨時(shí)問(wèn)推移，細(xì)胞核損傷程度逐漸降低。

2.5SE對(duì)鏈格孢活性氧含量的影響

胞內(nèi)ROS過(guò)度積累，會(huì)對(duì)膜脂、蛋白質(zhì)、核酸等產(chǎn)生氧化損傷，進(jìn)而觸發(fā)或者加速細(xì)胞凋亡進(jìn)程。Image J熒光定量分析結(jié)果（圖6）顯示：SE可以激發(fā)鏈格孢菌體產(chǎn)生過(guò)多的活性氧，SE組胞質(zhì)中ROS含量呈先升后降趨勢(shì)，在處理40min時(shí)出現(xiàn)峰值，與陰性對(duì)照相比差異極顯著（P<0.01）。SE處理會(huì)導(dǎo)致鏈格孢菌體內(nèi)大量的ROS產(chǎn)生，從而影響細(xì)胞的正常代謝過(guò)程。

2.6SE對(duì)菌體三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶的影響

琥珀酸脫氫酶（SDH）和蘋果酸脫氫酶（MDH）是真核細(xì)胞和原核細(xì)胞進(jìn)行TCA循環(huán)途徑中的關(guān)鍵酶，在細(xì)胞能量代謝中起著重要的作用，其活性變化可反映細(xì)胞的能量代謝狀況。圖7a為采用Bradford法制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程y=1.3771x+0.1356，相關(guān)系數(shù)R²=0.9956，具有良好線性關(guān)系，滿足樣品測(cè)試要求。SE對(duì)鏈格孢的SDH酶具有明顯的抑制作用。SE組SDH比活性與陰性對(duì)照相比降低了35.4%。SE組MDH比活性與陰性對(duì)照相比雖呈下降趨勢(shì)，但未有顯著差異（P>0.05）;由上可知，SE處理后會(huì)導(dǎo)致正常的三羧酸循環(huán)過(guò)程受阻，影響細(xì)胞的正常代謝。

3討論

近年來(lái)隨著綠色化學(xué)的興起，研究者們已經(jīng)從生物中發(fā)現(xiàn)大量有活性的天然產(chǎn)物，很大程度地豐富了化學(xué)資源。真菌化學(xué)成分種類豐富，包括甾醇、萜、生物堿、氨基酸、肽類、多糖等，已成為探索和發(fā)掘新化合物的重要領(lǐng)域。超臨界萃取是一種高效的提取技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離提取過(guò)程。本文通過(guò)超臨界萃取從黑曲霉菌絲體中提取得到萃取物SE。經(jīng)GC-MS分析出5種已知化合物，含量最高的兩種物質(zhì)為5-羥甲基糠醛（90.194%）和5，5-（氧二亞甲基）-雙-2-呋喃甲醛（7.843%）。有文獻(xiàn)報(bào)道5一羥甲基糠醛具有一定的醫(yī)藥價(jià)值，糠醛可用于農(nóng)藥合成，因此推測(cè)黑曲霉超臨界萃取物SE可能具有生物活性，本文對(duì)SE的抑菌機(jī)制進(jìn)行了研究。

研究結(jié)果顯示，SE對(duì)鏈格孢具有明顯的抑菌活性。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)液、胞外核酸和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果表明，SE不僅引起鏈格孢細(xì)胞膜滲透性的改變，還破壞了細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的泄漏。其作用效果與劉海燕等用細(xì)辛揮發(fā)油處理土生鏈格孢后結(jié)果相一致，SE處理導(dǎo)致鏈格孢的細(xì)胞膜完整性受到破壞。DAPI是一種能夠與DNA和RNA結(jié)合的熒光染料，核酸含量越高，熒光亮度也就越強(qiáng)。AL-LENE253研究表明糠醛能導(dǎo)致核染色質(zhì)異常，造成細(xì)胞核損傷。DAPI染色結(jié)果顯示經(jīng)SE作用后鏈格孢與陰性對(duì)照相比細(xì)胞核染色質(zhì)出現(xiàn)異常彌散，推測(cè)可能是SE導(dǎo)致急性的細(xì)胞核破碎化，而且隨時(shí)問(wèn)推移，細(xì)胞核損傷程度降低。活性氧（reactive OX-ygen species，ROS）是一類分子氧部分還原的分子或離子，具有很強(qiáng)的氧化活性，過(guò)量的ROS能夠使生物大分子如DNA、蛋白質(zhì)、脂類發(fā)生過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷，影響生理活性。SE可以激發(fā)菌體中產(chǎn)生過(guò)多的活性氧，SE作用鏈格孢40min時(shí)ROS含量比陰性對(duì)照增加了79.67%，試驗(yàn)結(jié)果與ALLEN等所描述糠醛導(dǎo)致胞內(nèi)活性氧積累，從而損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)一致。呼吸代謝是生物體進(jìn)行生命活動(dòng)的重要表現(xiàn)形式，其實(shí)質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)糖的氧化代謝過(guò)程，一旦糖的氧化代謝被抑制，供給細(xì)胞生命活動(dòng)所需的能量和合成代謝所需要的碳架及還原力就無(wú)法生成，使生物體的生長(zhǎng)和繁殖受阻。琥珀酸脫氫酶是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝和繁殖是必需的。本研究結(jié)果顯示，SE對(duì)鏈格孢SDH的活性具有明顯的抑制作用，SE作用鏈格孢SDH酶的比活性比陰性對(duì)照降低了35.4%，這與SE會(huì)抑制參與TCA循環(huán)和糖酵解的相關(guān)酶活論證相一致。推測(cè)其原因可能是SE與SDH相結(jié)合，導(dǎo)致酶的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，使酶的活性降低，從而導(dǎo)致菌體ATP和NADH的合成受阻，最終抑制其呼吸代謝系統(tǒng)。

綜上所述，SE通過(guò)影響細(xì)胞膜的正常功能、損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)和抑制真菌的呼吸代謝等方面抑制鏈格孢的生長(zhǎng)，其抑菌活性可能與萃取物中的活性物質(zhì)相關(guān)。本試驗(yàn)中得到的萃取物是多種化學(xué)成分的混合物，抑菌活性是一種主要成分的作用，還是多種化學(xué)成分協(xié)同作用，它們的反應(yīng)機(jī)制等問(wèn)題目前還未知，要解決這些問(wèn)題還有待于進(jìn)一步的科學(xué)研究。本文通過(guò)試驗(yàn)明確了黑曲霉超臨界萃取物主要成分的含量，并對(duì)其抑制鏈格孢的機(jī)制進(jìn)行了初探，為黑曲霉真菌資源和微生物農(nóng)藥的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)和依據(jù)。