環介導等溫擴增技術檢測小蒼蘭花葉病毒

樊榮輝 黃敏玲 鐘淮欽 葉秀仙 羅遠華

摘要小蒼蘭花葉病毒Freesia mosaic virus（FreMV）是侵染蘭花的主要病毒，嚴重影響其觀賞價值。本研究根據FreMV的外殼蛋白基因序列設計了一組特異性引物，經過一系列條件優化，建立了該病毒的RT-LAMP檢測方法。結果顯示設計引物能特異擴增FreMV，與其他4種病毒（菜豆黃花葉病毒Bean yellow mosaic virus、黃瓜花葉病毒Cucumbermosaic virus、建蘭花葉病毒Cymbidium mosaic virus和齒蘭環斑病毒Odontoglossum ringspot virus）不發生反應;該方法靈敏度為RT-PCR的10倍。田間檢測20份樣品中，RT-LAMP和RT-PCR檢測結果一致，檢出率為60%。在產物中加入熒光染料SYBR GreenI直接用肉眼觀察就可判斷樣品是否感染FreMV，可省去電泳分析的時間。該方法具有特異性強、靈敏度高、操作簡單、快速等特點。

關鍵詞小蒼蘭花葉病毒;RT-LAMP;檢測

中圖分類號：S436.8文獻標識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2018164

小蒼蘭Freesia hybrida為鳶尾科香雪蘭屬花卉，因其花色艷麗、高雅芳香、花序柔美搖曳，深受消費者喜愛。小蒼蘭花葉病毒Freesia mosaic virus（FreMV）是危害小蒼蘭最嚴重、最常見的病毒之一，造成花色雜，植物生長不良，觀賞價值降低，甚至造成種球退化，失去再利用的價值，已經成為小蒼蘭大規模生產的主要限制因素。目前，小蒼蘭病毒尚無特別有效的化學防治方法，培育和栽培無病毒苗成為防治小蒼蘭病毒的根本措施，在無毒苗培育過程中，經常需要對母本及脫毒苗進行病毒檢測，建立快速、靈敏的檢測技術顯得尤為重要。

目前，病毒檢測主要有酶聯免疫法和PCR檢測法等方法。酶聯免疫法是目前較常用的一種方法，但其存在靈敏度不高、假陽性等缺點。近幾年，靈敏度較高的PCR技術已成為常規的病毒檢測手段，但其對實驗設備要求比較高，不利于向基層檢驗部門推廣。環介導等溫核酸擴增技術（100p-mediated isothermal amplification，LAMP）采用6區域4條特異引物，在DNA鏈置換聚合酶（BstDNA polymerase）作用下，對靶基因進行恒溫擴增，具有靈敏度高、特異性強、操作簡單、快速、檢測結果肉眼可判等特點，擺脫了對昂貴儀器的依賴，能滿足基層的檢測需要。本研究以FreMV的外殼蛋白（CP）基因為靶標基因，設計4條引物，建立了可特異檢測該病毒的RT-LAMP檢測方法。

3討論

小蒼蘭由于香氣濃郁，花色種類豐富，顏色鮮艷，備受人們喜愛，是重要的切花及盆花。但當病毒病積累時會造成種球退化，限制小蒼蘭大規模生產。對種球進行復壯及培育無病毒苗是防止病毒病的重要措施，因此，建立快速、準確、高效的檢測方法，及時檢測出帶毒種球或脫毒苗，對阻止病毒病的傳播，從根源上預防病毒病具有重要意義。本試驗針對小蒼蘭花葉病毒建立的環介導等溫擴增技術具有擴增快速、高效、特異性好、操作簡便、不需要特殊儀器等優點，可以針對性地對小蒼蘭復壯種球和脫毒種苗進行檢測，從種源遏制病毒病的發生。本研究技術具有較高的應用價值，在基層和現場檢測中有很好的應用前景。

目前，常用的病毒檢測方法是PCR和酶聯免疫技術，這些方法均具有較好的檢測效果，但也存在耗時長，成本高的特點，不太適用于基層檢測。與常規PCR方法相比，本研究建立的LAMP技術保持了PCR技術優點，且不需特殊儀器，成本低，由于不需要熱循環，整個過程可以在60min內完成，更加省時。若在PCR產物中加入SYBR Green工可目測檢測結果，檢測更快捷方便，適合在基層應用。

LAMP技術使用4～6條引物，會進一步增強反應的特異性。引物設計至關重要，也較復雜和困難，除要遵循一般引物設計原則外，還有LAMP引物設計自身要注意的事項。對于GC含量較高序列或較短序列其引物設計更加困難。本試驗針對小蒼蘭花葉病毒CP基因設計引物，經驗證該引物的特異性良好。同時，本試驗建立的LAMP方法檢測FreMV具有較高的靈敏度，是RT-PCR的10倍，在病毒含量很少的脫毒苗的快速檢測方面有一定的優勢。