土霉素脅迫下小白菜種子萌發對橡膠廢水沼液的響應

傅悅 趙媛媛 俞花美 閆聰聰 馬瑞陽 蘇帆 葛成軍

摘 ?要 ?為認識橡膠廢水沼液中外源溶解性有機物（dissolved organic matter，DOM）對抗生素污染生物效應的影響，本文采用水培和土培兩種方法研究土霉素（oxytetracycline，OTC）對小白菜種子的萌發效應，在此基礎上探討外源DOM輸入后土霉素對小白菜發芽率和胚根、芽伸長的影響。結果表明：（1）水培中DOM促進種子萌發，土培中抑制萌發;土霉素在水培0～50 mg/L、土培0～100 mg/kg脅迫下小白菜種子發芽率影響差異不顯著;（2）在水培中，外源土霉素濃度與小白菜的胚根、芽長抑制率之間均呈顯著正相關性;在土培中，外源性土霉素濃度與小白菜的胚根、芽長抑制率呈顯著負相關性;（3）在水培和土培中，與對照組相比，DOM對小白菜的胚根伸長和芽伸長均起促進作用，水培促進率最高達55.05%，土培促進率最高達27.46%;（4）水培條件下，土霉素與DOM共存時對小白菜胚根伸長的抑制作用更明顯;土培條件下，土霉素與DOM共存時，低濃度的DOM促進小白菜的胚根伸長，隨著濃度的升高，促進作用下降。

關鍵詞 ?土霉素;DOM;小白菜;種子萌發;發芽率

中圖分類號 ?S19 ?????文獻標識碼 ?A

Abstract ?In order to understand the effects of exogenous DOM on the biological effects of antibiotic contamination， the effects of oxytetracycline （OTC） on the germination of Chinese cabbage seeds were studied by two methods： hydroponics and soil cultivation. The effects of oxytetracycline on germination rate， elongation of cabbage after exogenous DOM input were discussed also. DOM promoted seed germination in hydroponics and inhibited seed germination in soil culture. Oxytetracycline had no significant effect on seed germination rate under 050 mg/L and 0100 mg/kg of soil cultivation. In hydroponics the concentration of exogenous oxytetracycline was positively correlated with the inhibition rate of radicle and bud length of cabbage， while in soil cultivation， the concentration of exogenous oxytetracycline was negatively correlated with the inhibition rate of radicle and bud length of cabbage. Compared with the control group， DOM could promote the radicle and bud elongation of cabbage in hydroponics and soil cultivation， with the highest promotion rate of 55.05% and 27.46%. The inhibitory effect of oxytetracycline and DOM on the elongation of cabbage was more obvious under hydroponics. Under soil cultivation， when oxytetracycline co-existed with DOM， low concentration of DOM promoted radicle elongation of cabbage， and the promotion effect decreased with the increase of concentration.

Keywords ?oxytetracycline; DOM; cabbage; seed germination; germination rate

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.06.026

抗生素作為20世紀的偉大發現，一方面對人類的發展起到了深遠的影響，另一方面抗生素的大量使用會給環境帶來負面影響。抗生素被大量地運用到畜禽和水產養殖中。研究表明，進入動物體內的抗生素利用率極低，約有25%～90%的抗生素隨著糞便和尿液以原藥形式被排出體外，通過糞肥的施用和污水的灌溉進入土壤和水體等生態環境中并長期存留[1-4]。土壤中的抗生素可被植物吸收，特別是土霉素（oxytetra-cycline，OTC）極易在植物體富集，并通過食物鏈對人類的健康產生危害[5]。

溶解性有機物（dissolved organic matter，DOM）通常定義為可以溶解于水、酸或堿溶液的有機物。在生態系統中，它主要來源于土壤腐殖質、植物凋落物、根系分泌物以及土壤或水體中微生物的殘體[6-8]。DOM對水生生態系統的形成起著不可或缺的作用，能被土壤吸附，可以有效降低土壤對抗生素的吸附能力，增強土壤系統的耐受性，并與各種污染物相互作用，減輕污染物的毒性，影響遷移率，降低生物有效性[9-11]。DOM可減輕土壤中Phe的生態毒性[12]，一定范圍內的DOM能抑制氟氯氰菊酯的毒性[13];同時也有相反研究表明DOM能促進污染物生物有效性[14]。

就國內來說，沼液還田是目前最簡單也是使用最多的方式，它能夠有效提高土壤肥力，改變土壤微生物環境，增加農產品的產量[15-16]。目前天然橡膠廢水沼液處理成本較高，出水不達標的情況較普遍，而海南作為全國最大的天然橡膠生產基地，橡膠廢水的資源化利用就顯得尤為重要，有研究表明橡膠廢水的施用對蔬菜產量和農作物生長起到促進作用[17-18]。海南島本地畜禽資源豐富，文昌雞、臨高豬、東山羊等受到廣大消費者喜愛，當地用于畜禽的抗生素使用量較大。目前溶解性有機物對抗生素影響的研究中選用養殖場沼液的較多，選用天然橡膠廢水沼液作為溶解性有機物的研究尚罕見報道。

本文選用小白菜作為供試作物，通過土培和水培實驗研究外源橡膠廢水沼液DOM和土霉素輸入土壤后對小白菜種子萌發的影響，并對比土霉素脅迫下輸入不同量的DOM對小白菜的根與芽伸長的影響效應，研究土霉素對小白菜的植物毒性，以期對熱帶地區橡膠廢水沼液生態資源化利用提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試土壤為磚紅壤，采自海南大學熱帶農林學院基地農田表層土壤（0～20 cm），土樣自然風干后，過2 mm尼龍篩。供試土壤基本理化性質：pH為5.31，全氮、全磷、全鉀和有機質的含量分別為4.21%、0.15%、0.76%和2.98%。

供試作物小白菜（Brassica rapa var. glabra），品種為揭農三號甜白菜，產地為廣東省揭陽市，培育單位為保豐種子商行。在實驗前，用蒸餾水浸泡8 h，除去浮于水面的種子，瀝干水分后備用。

供試抗生素選用土霉素，純度98%，購自Adamas公司。

溶解性有機物（DOM）前驅物來源于海南省儋州市某橡膠加工廠廢水，該加工廠天然橡膠廢水的處理流程為：酸凝槽出水——調節池——一級厭氧池——二級厭氧池（厭氧UASB池）——一級好氧池——二級好氧池——脫氧除磷池——混凝沉淀池——清水池，采集廢水的水樣來自清水池的好氧終水，其溶解性有機碳的濃度為128.5 mg/L。發芽率實驗在受控智能人工氣候培養箱（杭州錢江ZRX-300）中進行，實驗用水由Spring-S60i+PALL超純水系統制備。

1.2 ?方法

1.2.1 ?水培 ?每個培養皿中添加量均為10 mL水溶液，培養皿底部鋪上2層濾紙。DOM添加量為1、3、5 mL，土霉素濃度梯度設置為0、10、20、30、40、50 mg/L，處理分別為：對照（CK），添加不同量DOM，添加不同濃度梯度土霉素，添加30 mg/L土霉素+不同量DOM。

1.2.2 ?土培 ?稱取50 g的風干土壤于培養皿中，DOM添加量為1、3、5 mL，土霉素濃度梯度設置為0、5、10、25、50、100 mg/kg，用去離子水調節土壤最大持水量的60%左右。處理分別為：對照（CK），添加不同量DOM，添加不同濃度梯度土霉素，添加50 mg/kg土霉素+不同量DOM。

2種培養方式均選取20粒籽粒飽滿、大小一致的小白菜種子，均勻地擺放于培養皿中培養7 d，對芽長大于2 mm的小白菜幼苗進行測量。實驗共設24個處理，每個處理設置3個平行，置于25?℃人工氣候培養箱暗處培養，定期觀察小白菜的生長情況，培養期間定期補充損失的水分。

1.2.3 ?測定項目 ?選取發芽率、胚根生長和芽伸長及其抑制率作為測定指標。

1.3 ?數據處理

實驗數據采用Excel 2016軟件和SPSS 17.0軟件進行統計、繪圖以及回歸分析。統計方法采用Pearson相關分析。

2 ?結果與分析

2.1 ?DOM對土霉素脅迫下小白菜發芽率的影響

水培中，白菜種子在濃度10～50 mg/L的土霉素脅迫下，均呈現不同程度的促進作用，其發芽率在70%～85%之間波動，發芽率與對照組相比差異不顯著（P>0.05）。土培與水培的結果相似（圖1），小白菜種子萌發受到不同程度的促進作用，在土霉素濃度為50 mg/kg時，發芽的數量最高，但差異未達顯著水平（P>0.05）。

由圖2可知，在水培中，與對照組相比，添加土霉素的DOM處理（P>0.05）和純DOM的處理（P>0.05）均對種子的萌發起到促進的作用。隨著施入DOM量的增多，促進效果反而降低。在土霉素脅迫的處理中，DOM添加量的多與少對小白菜的發芽率影響不明顯。土霉素脅迫下的DOM處理對小白菜的促進作用略低于純DOM處理的促進作用，說明土霉素對小白菜種子的發芽

A：水培;B：土培。

起到了一定的抑制作用。而土培條件下，DOM對種子萌發起到了抑制的作用，且抑制效應隨DOM量增加而明顯。土霉素脅迫下的DOM處理（P>0.05）和純DOM（P<0.01）處理下小白菜的發芽率則呈現出相反趨勢。土霉素脅迫下的DOM處理的發芽率，隨著DOM添加量的增多，其抑制效果減弱。在土培條件下，純DOM處理抑制萌發，在添加土霉素后緩解了抑制作用。

2.2 ?DOM對土霉素脅迫下小白菜芽伸長的影響

2.2.1 ?不同濃度的土霉素對小白菜芽伸長的影響 ?水培中不同濃度的土霉素對小白菜芽伸長的影響如圖3所示。從圖中可以看到，當土霉素濃度為10～50 mg/L時，芽長的抑制率均為正值，表明小白菜的芽伸長受到土霉素的抑制作用，抑制效應隨著濃度的增大而增強。與對照組相比，土霉素濃度和小白菜的芽伸長呈顯著的線性相關性（P<0.05）。在土培中，加入土霉素后，其芽長的增長趨勢與水培完全相反。施入5 mg/kg的土霉素，小白菜的芽長與對照組相一致。隨著土霉素濃度的增高，芽長抑制率變為負值，說明土霉素對芽增長起到了促進的作用。土霉素濃度為5～100 mg/kg時，其曲線先下降后回升，在土霉素為50 mg/kg時，其促進的效果達到最強。在土壤中，不同的土霉素濃度對小白菜的芽伸長的影響達到顯著性差異（P<0.05）。

2.2.2 土霉素脅迫下DOM對小白菜芽伸長的影響 ?純DOM處理下的小白菜芽長抑制率為負值（圖4）。在水培中，純DOM處理促進小白菜的芽伸長，DOM添加量為0～1 mL時，對小白菜種子的芽伸長有輕微的抑制作用;隨著添加量的增多，則從抑制轉為促進，且促進的作用隨著添加量的增多而增強。從圖中可以看到，土霉素脅迫下的DOM處理的芽伸長趨勢與純DOM處理的培養結果大致相同，在添加土霉素的處理中加入DOM后，芽長抑制率由正值轉為負值。通過觀察純DOM處理與DOM+土霉素處理的結果可知，在水溶液中，DOM能夠有效緩解土霉素的脅迫，促進芽的伸長。在土培中，添加1～3 mL的DOM會對芽伸長起到促進的作用，且添加量越多，促進效果越明顯。加入土霉素之后，芽伸長出現了相

A：水培;B：土培。

反態勢，DOM添加量為1～3 mL，其芽長抑制率為負值;添加量為3～5 mL，其芽長抑制率為正值，說明DOM抑制了芽長的增長。DOM添加量為0～1 mL時，對芽伸長起到了促進的作用;添入量為1～3 mL，促進效果減弱，DOM添加量為3 mL時，其芽長抑制率基本與對照組持平;施入量為3～5 mL時，出現明顯的抑制作用。通過對比，發現土壤中土霉素脅迫下DOM對小白菜芽伸長的作用與水溶液中不一致。

以小白菜的芽長抑制率對土霉素濃度、DOM添加量以及DOM與土霉素共存時DOM添加量進行回歸分析，由表1可見，在水培和土培中，土霉素濃度、DOM添加量與芽伸長呈對數相關，DOM與土霉素共存時DOM添加量與芽伸長呈線性相關。在3種處理條件下，水培中芽的抑制率的相關性均高于在土培中。2.3.1 ?土霉素濃度對小白菜胚根生長的影響 ?水培中不同濃度的土霉素對小白菜胚根生長的影響如圖5所示。在土霉素濃度10～50 mg/L，芽長的抑制率均為正值且在40%～60%之間波動，表明土霉素對小白菜的根生長起到抑制的作用，抑制效應隨著濃度的增大而增強，土霉素濃度與胚根長呈顯著性相關（P<0.05）。在土培中，胚根長抑制率呈負值，說明土霉素對胚根長起到了促進的作用，其促進作用是先增強后減弱，在土霉素為5～50 mg/kg時，其促進作用隨著土霉素濃度增大而增強（P<0.05），在50 mg/kg處理下達到最大值，土霉素濃度為50～100 mg/kg時，其促進作用減弱。在土培中，小白菜的胚根生長的效應與芽長相一致。

2.3.2 DOM對土霉素脅迫下的小白菜胚根長抑制率的影響 ?在水培條件下，純DOM處理的胚根長抑制率為負且呈上升趨勢，表明DOM對胚根生長起到促進的作用。從圖6可以看出，隨著DOM量的增加，對胚根生長促進的效果減弱。施入土霉素后，與DOM共同作用下胚根長抑制率為正值，說明小白菜的胚根長受到了明顯的抑制。在土霉素脅迫下的處理中，施加DOM的處理與不加DOM的處理相比，隨著DOM添加量的增加，加重對小白菜胚根生長的抑制作用。土培條件下，小白菜在純DOM處理下與在土霉素脅迫處理下的胚根生長抑制率均為負值，說明小白菜胚根長均在兩種處理中受到了促進作用。純DOM處理的抑制率曲線呈上升趨勢，隨著量的增加，其促進作用減弱。在土霉素脅迫下的處理中添加DOM，DOM的促進效應呈現出先增強后減弱的現象，在DOM添加量為0～1 mL時，其促進效應優于對照組;DOM添加量為1～5 mL時，促進效應弱于對照組。由圖6可知，在土霉素與DOM共同作用下，其DOM添加量越高，其促進效果越弱。

A：水培;B：土培。

以小白菜的胚根長抑制率對土霉素濃度、DOM添加量以及DOM與土霉素共存時DOM添加量進行回歸分析，由表2可見，在水培和土培中，土霉素、DOM與芽伸長呈對數相關，DOM與土霉素共存時呈線性相關。在水培中，土霉素對芽長的IC50為1168.691 mg/L，胚根長的IC50為26.9 mg/L，芽伸長的IC50明顯大于胚根生長，說明芽對土霉素的耐受性更強，根對土霉素敏感性更大。

3 ?討論

前人研究普遍表明土霉素會抑制植物芽、根的伸長，DOM能夠有效降低生物的有效性[1-3， 15， 19]。本研究中，土霉素對小白菜的生長產生一定的影響，其發芽率的結果與安靖等[19]研究結果相一致。在水培中，土霉素對小白菜的芽伸長和胚根生長均表現出抑制作用，濃度越高，抑制效果越強;在土壤中，胚根生長和芽伸長均呈現先促進后促進減弱的現象，造成這一趨勢的原因可能是因為土壤具有一定的吸附能力以及緩沖的作用，削弱了土霉素對小白菜芽、胚根長的抑制作用。在0～100 mg/kg的土霉素濃度處理下未對小白菜的胚根生長、芽伸長產生抑制作用，可能由于當前土培所設最高土霉素濃度未達到脅迫小白菜胚根生長和芽伸長的濃度。在水培和土培中，純DOM的處理能夠有效促進小白菜的胚根伸長和芽伸長。但是在土霉素脅迫下施加DOM的處理，與只有土霉素的處理相比，DOM對小白菜的芽、根抑制率，在土培和水培中胚根長和芽長呈現出完全相反的兩種情況。在水培中，土霉素脅迫下加入不同量的DOM，DOM對芽起促進作用，對根起抑制作用;在土壤中，土霉素脅迫下加入不同量的DOM，DOM對芽起到抑制作用，對根產生先促進后抑制的作用。但DOM對植物生長、發育所起到的作用還有待進一步探討。有文獻表明DOM會影響抗生素在土壤上的吸附行為，一般認為DOM會通過增加土壤中有機C的濃度、暴露出極性官能團、與抗生素競爭吸附點位使得吸附容量增大，但是也有其他研究表明DOM會降低抗生素、農藥在土壤中的吸附，如Yaron Drori的研究中提到DOM能改變原來土壤的有機質性質，降低土壤對抗生素的吸附作用[20-22]。Song等[23]發現DOM提高了除草劑對小麥的毒性，認為是DOM的配位體與除草劑結合，提高了除草劑的生物有效性。所以橡膠廢水DOM對土霉素脅迫下的生物有效性促進或抑制的原因需要考慮土壤中土霉素的吸附解吸行為、土霉素的疏水性成分、DOM配位體與土霉素的結合以及DOM的濃度、分子大小等[14， 24-25]，其促進或抑制的濃度閾值點尚待于進一步的研究。

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