GB/T 8312—2013高效液相色譜法與紫外分光光度法檢測(cè)固態(tài)速溶茶中咖啡堿含量的比較

胡銀鳳，吳小婷，陳秋香，朱宏斌，王淑鳳*

1.大閩食品（漳州）有限公司，363000；2.長泰縣質(zhì)量計(jì)量檢驗(yàn)檢測(cè)所，363900

咖啡堿又名咖啡因，是固態(tài)速溶茶中含有的生物堿之一，屬黃嘌呤衍生物，化學(xué)名稱為1,3,7-三甲基黃嘌呤，它與可可堿和茶葉堿通過次黃嘌呤核苷酸的轉(zhuǎn)變而成，并在嘌呤代謝中互相轉(zhuǎn)化。咖啡堿的基本結(jié)構(gòu)是嘌呤環(huán)，它是由嘧啶和咪唑縮合而成的雜環(huán)體系。咖啡堿是具有絹狀光澤的針狀晶體，無水咖啡堿為白色粉末，熔點(diǎn)235～238°C，在120°C下升華，能溶于乙醇、丙酮，易溶于氯仿，較難溶于乙醚和苯。咖啡堿的水溶液呈中性，能與酸生成鹽，咖啡堿能興奮大腦皮層，使人精神興奮，無臭，具有苦味，是茶葉重要的滋味物質(zhì)之一，占固態(tài)速溶茶總量的2%～12%不等，與兒茶素、茶黃素等形成的絡(luò)合物具有鮮爽味[1-4]。

當(dāng)前，各種固態(tài)速溶茶飲料已經(jīng)成為飲食中攝取咖啡堿頻率較高的一個(gè)重要來源[5]。因此，采用簡便、快速、可靠、分析成本低的分析方法來

對(duì)固態(tài)速溶茶飲料中咖啡堿含量進(jìn)行檢測(cè)非常重要。咖啡堿傳統(tǒng)的分析方法有碘量法[6]、薄層色譜法[7-8]、近紅外光譜法[9-11]、氣相色譜法[12-13]、紫外分光光度法[14-16]和高效液相色譜法[17-21]等。《茶咖啡堿測(cè)定》（GB/T 8312—2013）中規(guī)定茶葉及固態(tài)速溶茶中咖啡堿的檢測(cè)可采用高效液相色譜法（HPLC）或紫外分光光度法（UV）。本文對(duì)這兩種方法檢測(cè)的差異進(jìn)行探討，并嘗試計(jì)算這兩種方法的檢測(cè)結(jié)果間的轉(zhuǎn)換系數(shù)[22]。

一、材料與方法

1.儀器與設(shè)備

Waters 2487高效液相色譜儀（美國沃特世公司），TU 1900雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用公司），AR1140型電子分析天平（0.0001 g，美國奧豪斯公司），明澈-D 24UV純水/超純水系統(tǒng)（美國密理博公司），SHA-B水浴恒溫振蕩器（金壇市新航儀器廠），Phenomenex Luna C18色譜柱（美國菲羅門公司）。

2.試劑及標(biāo)準(zhǔn)液

甲醇（色譜純，上海安譜CNW），鹽酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），氧化鎂（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），堿式乙酸鉛（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品（99%，美國阿法埃莎公司）。

3.樣品前處理

（1）高效液相色譜法

準(zhǔn)確稱取0.1 g左右（精確至0.0001 g）速溶茶樣品，置于100 mL具塞三角燒瓶中，加入0.9 g左右氧化鎂及60 mL沸水，放于水浴恒溫振蕩器中加熱振蕩提取20 min，提取完畢后立即趁熱減壓過濾，濾液移入100 mL容量瓶中，待冷卻后，用水定容至刻度，混勻后過0.45 μm濾膜，待測(cè)。

（2）紫外分光光度法

準(zhǔn)確稱取0.2 g左右速溶茶樣品，用80°C水溶解，冷卻后定容至100 mL，作為提取液。準(zhǔn)確移取10 mL提取液于100 mL容量瓶中，加入4 mL鹽酸溶液，1 mL堿式乙酸鉛溶液，用水稀釋并定容至刻度，搖勻并靜置澄清后過濾。再移取濾液25 mL，置于50 mL容量瓶中，加入0.1 mL硫酸溶液，用水稀釋至刻度，搖勻。靜置澄清后過濾待測(cè)。

4.儀器條件

（1）高效液相色譜條件

檢測(cè)波長：280 nm，流動(dòng)相：甲醇-水溶液（30∶70，V/V），流速：1 mL/min，柱溫箱溫度：40°C，進(jìn)樣量：10 μL。

（2）紫外分光光度計(jì)條件

紫外波長：274 nm，比色皿：10 mm石英比色皿。

5.檢測(cè)方法

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣液濃度檢測(cè)

①高效液相色譜法

準(zhǔn)確稱取一定量的咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品，用乙醇-水溶液（1∶4，V/V）溶解后制備成500 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再用水逐級(jí)稀釋至10、20、50、100 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。上機(jī)檢測(cè)得到咖啡堿不同濃度的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，測(cè)得線性回歸方程。依據(jù)高效液相色譜法的樣品前處理步驟處理樣品，檢測(cè)樣液，根據(jù)回歸方程，可得樣液濃度，然后計(jì)算結(jié)果。

②紫外分光光度法

準(zhǔn)確稱取一定量的咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品，用水將其稀釋成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再用水將其稀釋成50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。分別吸取0、1、2、3、4、5 mL標(biāo)準(zhǔn)工作液于25 mL容量瓶中，分別各加入1 mL鹽酸溶液，用水稀釋至刻度，即濃度分別為0、2、4、6、8、10 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，以試劑空白溶液為參比，上機(jī)檢測(cè)吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，測(cè)得線性回歸方程，依據(jù)紫外分光光度法的樣品前處理步驟處理樣品，檢測(cè)樣液，根據(jù)回歸方程，可得樣液濃度，然后計(jì)算結(jié)果。

（2）方法精密度試驗(yàn)

分別稱取速溶紅茶、速溶綠茶、速溶烏龍茶3個(gè)不同類型的速溶茶樣品，每個(gè)樣品平行稱取6份，再分別使用高效液相色譜法和紫外分光光度法檢測(cè)，分別計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

（3）方法準(zhǔn)確度試驗(yàn)

分別稱取速溶紅茶、速溶綠茶、速溶烏龍茶3個(gè)不同類型的速溶茶樣品，每個(gè)樣品平行稱取6份，每份樣品分別加入咖啡堿標(biāo)液（10 mg/mL）0.2 mL和0.4 mL，分別使用上述兩種不同檢測(cè)方法檢測(cè)各固態(tài)茶粉中的咖啡堿含量，計(jì)算其回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

二、結(jié)果與分析

1.兩種方法的精密度比較

采用高效液相色譜法和紫外分光光度法檢測(cè)不同速溶茶粉中咖啡堿的含量，檢測(cè)結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）如表1、表2。結(jié)果表明，紫外分光光度法的檢測(cè)結(jié)果明顯高于高效液相色譜法，高效液相色譜法檢測(cè)結(jié)果RSD在1.5%～1.7%之間，而紫外分光光度法的RSD在1.1%～3.3%之間。

表1 兩種方法檢測(cè)的咖啡堿含量（n=6）%

表2 兩種方法檢測(cè)咖啡堿的標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6） %

兩種檢測(cè)方法所得結(jié)果有差異的原因，主要是速溶茶中含有的多酚類、糖類及色素類物質(zhì)會(huì)干擾咖啡堿在分光光度計(jì)上的特征吸收光譜的吸收值，不同茶類速溶茶中這些物質(zhì)的含量各異，因此使用紫外分光光度法檢測(cè)不同茶類速溶茶中的咖啡堿結(jié)果相對(duì)較不穩(wěn)定，且往往檢測(cè)結(jié)果稍高于高效液相色譜法。使用高效液相色譜法檢測(cè)時(shí)，咖啡堿物質(zhì)溶解在流動(dòng)相中，在色譜柱中與其他組分（如兒茶素、咖啡酸等）因物質(zhì)極性不同而分離后，再對(duì)其含量進(jìn)行檢測(cè)，因此，雜質(zhì)對(duì)其干擾相應(yīng)較小，檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性也相對(duì)較穩(wěn)定。

2.兩種方法的準(zhǔn)確度比較

高效液相色譜法與紫外分光光度法檢測(cè)速溶茶中的咖啡堿含量及加標(biāo)回收率結(jié)果如表3，加標(biāo)平均回收率與標(biāo)準(zhǔn)偏差如表4。從表3、表4中可見，高效液相色譜檢測(cè)不同茶類速溶茶中的咖啡堿加標(biāo)平均回收率為96.7%～99.7%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～2.2%；而紫外分光光度法檢測(cè)的加標(biāo)平均回收率在86.6%～91.4%之間，標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.1%～7.2%。因此，相比于紫外分光光度法，高效液相色譜法更能真實(shí)反映速溶茶中咖啡堿的含量。

3.兩種方法的操作便捷性比較

高效液相色譜法在檢測(cè)過程中使用的試劑甲醇、乙醇及氧化鎂在危險(xiǎn)性及毒性上均低于紫外分光光度法所使用的堿式乙酸鉛、鹽酸和硫酸等，能夠更好地保障實(shí)驗(yàn)人員的人身安全。此外，使用高效液相色譜法檢測(cè)單個(gè)樣品一般情況下均能夠在1 h內(nèi)完成全部檢測(cè)過程，而紫外分光光度法檢測(cè)單個(gè)樣品需4～5 h。因此，使用高效液相色譜法檢測(cè)能夠大大縮短檢測(cè)的時(shí)間，提高檢測(cè)效率。

4.兩種方法檢測(cè)結(jié)果間的換算

由于高效液相色譜法檢測(cè)速溶茶中的咖啡堿含量在精密度、準(zhǔn)確度、檢測(cè)效率上均好于紫外分光光度法，且在操作安全性上也優(yōu)于紫外分光光度法，因此，該方法也是中國及世界各國和地區(qū)在檢測(cè)茶葉及茶粉中咖啡堿的首選方法。但是，由于該方法所需的高效液相色譜儀價(jià)格較昂貴，對(duì)國內(nèi)許多小型企業(yè)實(shí)驗(yàn)室來說投入較大，可能無法滿足部分客戶使用高效液相色譜法檢測(cè)咖啡堿含量的需求。因此，本研究進(jìn)一步探尋以上兩種方法檢測(cè)咖啡堿含量的結(jié)果是否具有一定的換算關(guān)系。

表3 兩種方法檢測(cè)速溶茶中的咖啡堿含量及加標(biāo)回收率結(jié)果（n=6）

表4 兩種方法檢測(cè)速溶茶中的咖啡堿加標(biāo)平均回收率與標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）%

選用速溶紅茶、速溶綠茶、速溶烏龍茶各50只樣品，分別采用高效液相色譜法和紫外分光光度法檢測(cè)樣品中的咖啡堿含量，檢測(cè)結(jié)果如表5。從表5中數(shù)據(jù)可見，采用高效液相色譜法和紫外分光光度法檢測(cè)咖啡堿含量，速溶紅茶兩者之間的換算系數(shù)在0.70～0.85之間，平均換算系數(shù)為0.77，50個(gè)系數(shù)之間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.43%；速溶綠茶的換算系數(shù)在0.49～0.68之間，平均換算系數(shù)為0.60，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.72%；速溶烏龍茶的換算系數(shù)在0.74～0.89之間，平均換算系數(shù)為0.83，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.39%。從數(shù)據(jù)可見，不同茶類的速溶茶采用高效液相色譜法及紫外分光光度法兩種方法檢測(cè)咖啡堿結(jié)果之間的換算系數(shù)有較大的差異，但同種速溶茶之間的換算系數(shù)差異較小，均在一個(gè)比較穩(wěn)定且合理的區(qū)間內(nèi)，3種速溶茶換算系數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。因此，我們可以采用它們的平均換算系數(shù)，即0.77、0.60和0.83作為高效液相色譜法和紫外分光光度法檢測(cè)速溶紅茶、速溶綠茶及速溶烏龍茶中咖啡堿結(jié)果間的換算系數(shù)，在一定程度上解決無高效液相色譜法檢測(cè)條件的困難。

三、結(jié)論

通過比較GB/T 8312—2013中的兩種方法在檢測(cè)速溶茶咖啡堿含量之間的差異，發(fā)現(xiàn)高效液相色譜法在檢測(cè)數(shù)據(jù)的精密度、準(zhǔn)確度、檢測(cè)效率及對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的安全性上比紫外分光光度法均有明顯優(yōu)勢(shì)。

表5 兩種方法檢測(cè)咖啡堿的結(jié)果比較

此外，通過試驗(yàn)得出，采用高效液相色譜法和紫外分光光度法檢測(cè)速溶紅茶、速溶綠茶及速溶烏龍茶咖啡堿含量時(shí)，兩種方法檢測(cè)結(jié)果之間的換算系數(shù)分別為0.77、0.60及0.83，這些換算系數(shù)可為需要采用高效液相色譜法檢測(cè)上述3種速溶茶中的咖啡堿含量而又沒有條件的小型實(shí)驗(yàn)室提供參考。