低氧預處理人臍帶間充質干細胞治療早發性卵巢功能不全小鼠的效果研究

趙 越 阮祥燕,2* 王鳳春 李揚璐 程姣姣 Alfred O. Mueck,2

(1.首都醫科大學附屬北京婦產醫院內分泌科，北京 100026；2. 德國圖賓根大學婦產醫院婦女健康部與婦女健康研究中心，圖賓根 D-72076，德國；3.首都醫科大學附屬北京婦產醫院產房，北京 100026)

早發性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency, POI)是女性在40歲之前卵巢活動衰退的臨床綜合征，以月經紊亂(如停經或稀發月經)、卵巢萎縮、體內雌激素水平低落、促性腺激素高達絕經期水平的現象，繼續進展在40歲前卵巢功能衰竭，就會導致卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)，嚴重影響女性生殖健康和內分泌平衡[1]。由于國內缺乏權威的流行病學調查，以往文獻[2]顯示卵巢早衰在育齡女性中發病率約為1%。在當今高壓力、快節奏的影響下，POI發病率呈上升和年輕化趨勢，已影響了超過10%的女性健康[3]。POF治療極為困難，即使通過輔助生殖技術，也很難實現受孕[4]，POI導致的生育力喪失及低雌激素狀態給女性生殖健康帶來了巨大威脅。鑒于常規治療方法的局限性，臨床和科研工作的關注點集中在改善POI患者卵巢功能及恢復生育能力。人臍帶來源的間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)，來源豐富，易采集，病原微生物感染率和免疫原性較低，無致瘤性和倫理限制等優點[5-7]，為改善POI/POF患者卵巢功能及恢復生育能力帶來了希望，相關分子機制的探究更是為POI/POF合并不孕癥患者精準治療提供了一個很有價值的研究方向。研究[8]表明，短期低氧刺激在早期會抑制細胞的活力及增生，引起細胞損傷甚至凋亡，但隨后細胞為了適應低氧環境，又反而會增強其遷移能力，激活一些促進存活的信號通路，表達一些生長因子等，如低氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及干細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)等。本研究應用hUCMSCs來治療因化學治療藥物引起的POI小鼠，同時與低氧預處理的hUCMSCs治療效果進行比較，通過檢測小鼠血中激素水平及小鼠卵泡發育情況，研究hUCMSCs及低氧預處理條件下hUCMSCs對POI小鼠的治療作用，為臨床研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級CD-1小鼠，雌性，6～7周齡，60只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0006。飼養于首都醫科大學實驗動物部，飼養所用食物、墊料、水、籠具等均經嚴格消毒滅菌處理，按首都醫科大學實驗動物倫理委員會批準方案進行實驗(倫理編號：AEEI-2015-112)。

1.2 主要試劑及儀器

1, 4-丁二醇二甲烷磺酸鹽(白消安)及環磷酰胺單水合物，購自上海化成工業發展有限公司。鼠雌二醇(estradiol，E2)ELISA試劑盒、鼠卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)ELISA試劑盒及鼠抗苗勒管激素(anti Müllerian hormone, AMH)ELISA試劑盒，購自上海酶聯生物科技有限公司。PE鼠抗人CD73、APC鼠抗人CD90、BV421鼠抗人CD105、APC鼠抗人CD14、APC鼠抗人CD19、APC鼠抗人CD34、 APC鼠抗人CD45、APC鼠抗人人白細胞抗原-D(human leukocyte antigen-D，HLA-DR)抗體購自美國BD公司。Multiskan FC型酶標儀、3111型二氧化碳培養箱購自上海賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 hUCMSCs的取材、分離、培養、鑒定及低氧誘導

選取自然分娩健康足月新生兒的健康產婦共20例，無任何疾病史，定期產檢，無任何產科合并癥，同時排除梅毒、肝炎、艾滋病等傳染病，經產婦同意，胎盤娩出后，無菌條件下留取新鮮臍帶組織10 cm，臍帶中無明顯血管迂曲，放在組織保存液中。實驗經首都醫科大學附屬北京婦產醫院倫理委員會批準通過。所有入組參加研究者均自愿簽署知情同意書。

臍帶采集后在6 h內進行處理，將臍帶雙側帶夾痕及瘀血的部分切除，并剃除臍帶中的靜脈及動脈，將剩余組織剪成3.0～5.0 mm3小塊，種入預先用少量完全培養基濕潤的T25細胞培養瓶底壁，將培養瓶底壁朝上置于37 ℃、為5%(體積分數)的CO2飽和濕度孵箱中，過夜后翻轉。每24 h加入1 mL上述培養基，72 h后全量換液，以后每周換液2次。觀察貼塊周圍貼壁細胞爬出情況。2周后去貼塊，于培養的第14天計數集落數。當細胞達70%～80%融合時，以含1.25 g/L胰蛋白酶、1 g/L乙二胺四乙酸的消化液消化后，以2.5×103～5.0×103/cm2密度接種傳代培養，計為第1代(P1)細胞。取第2代的間充質干細胞，胰酶消化后制成單細胞懸液。分別加入抗人CD29、CD44、CD73、CD105、CD90、CD14、CD34、CD45、CD106、CD133、HLA-DR單抗各5 μL，鼠IG為陰性對照，4 ℃孵育30 min，流式細胞儀檢測。

低氧誘導臍帶間充質干細胞的步驟為上述正常培養的臍帶間充質干細胞達到70%～80%融合時，更換新鮮培養基，置于37 ℃，充滿體積分數為1% O2、5% CO2及94%氮氣的培養箱中，連續培養48 h，收取細胞制備單細胞懸液。未進行低氧誘導的臍帶間充質干細胞則當細胞培養達到 70%～80% 融合時，收取細胞制備單細胞懸液。

1.4 小鼠POF模型建立及干細胞治療

雌性CD-1小鼠60只，在動物房后適應性飼養1周后開始建模。按體質量采用數字表法隨機分為4組，每組15只，分別為：正常對照組(A組)、POF模型對照組(B組)、 hUCMSCs組(C組)、低氧hUCMSCs組(D組)。除A組外，各組小鼠分別皮下注射白消安(12 mg/kg，溶于DMSO)和腹腔注射環磷酰胺[120 mg/kg，溶于0.9%(質量分數)氯化鈉注射液]，A組分別注射等體積DMSO和0.9%(質量分數)氯化鈉注射液，每日8∶ 00棉簽輕取陰道分泌物涂片，巴氏染色，觀察陰道脫落細胞變化，當連續10 d觀測到持續動情間期，視為POI建模成功[6]，造模1周后給藥。C組和D組小鼠分別靜脈注射hUCMSCs單細胞混懸液和低氧誘導hUCMSCs單細胞混懸液(100 μL每鼠，含細胞數量為2 × 106個)。

1.5 觀察指標

在實驗第21天分別從各組中取5只小鼠，眼球采血，肝素抗凝，分離血漿于-80 ℃ 凍存，擇期檢測其E2、FSH、AMH含量；收集小鼠卵巢，以甲醛固定后，行組織病理學檢查，進行卵泡計數。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 hUCMSCs形態學觀察

經分離、培養得到的hUCMSCs均貼壁生長，呈均一的梭形，渦旋狀排列(圖1)。

2.2 流式細胞術檢測hUCMSCs表面標志物

分離培養的第二代hUCMSCs流式細胞術檢測結果，陽性標志物：CD73、CD90和CD105陽性率均大于 95%，陰性標志物：CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR均不高于2%(圖2)。

2.3 激素水平

與A組比較，B組小鼠血漿E2及AMH降低(P<0.05)，差異有統計學意義。與B組比較，C組和D組的小鼠血漿中E2及AMH(P<0.05)，差異有統計學意義；B組小鼠血漿FSH有所上升，但各組差異無計學意義(表1)。

圖1 hUCMSCs光鏡圖Fig.1 Optical microscope of hUCMSCshUCMSCs: human umbilical cord mesenchymal stem cells.

圖2 hUCMSCs表面標志物的流式鑒定Fig.2 Flow characterization of surface markers of hUCMSCshUCMSCs: human umbilical cord mesenchymal stem cells.

GroupNumberofcasesE2/(pmol·L-1)FSH/(mIU·mL-1)AMH/(pg·mL-1)A1536.96±2.886.35±2.612923.75±166.98B1531.71±3.49?6.77±2.362221.53±249.25?C1534.21±3.22#6.15±2.582513.50±240.51#D1534.43±3.16#6.29±2.252679.82±126.24#F-11.691.388.50P-0.0280.3050.003 ?P<0.05vsgroupA;#P<0.05vsgroupB;E2:estrogen;FSH:folliclestimulatinghormone;AMH:anti-Müllerianhormone;hUCMSCs:humanumbilicalcordmesenchymalstemcells;A:control;B:POFcontrol;C:normalhUCMSCs;D:hypoxicpretreatedhUCMSCs;POF:prematureovarianfailure.

2.4 卵巢組織HE染色形態學觀察和各級卵泡計數

采取連續切片法，每張切片厚度5μm，取10張切片，常規HE染色，鏡下觀察各組標本的切片中各階段(始基卵泡、初級卵泡、次級卵泡和成熟卵泡、閉鎖卵泡)卵泡情況，同時觀察卵巢中顆粒細胞、黃體及間質等組織學變化。結果顯示，A組小鼠卵巢體積較大，可見生長活躍、發育良好的各級卵泡和黃體，卵巢組織未見炎性細胞浸潤。B組小鼠卵泡萎縮明顯，結構混亂，各階段生長卵泡數目明顯減少，僅有少數原始卵泡，卵巢卵母細胞周邊顆粒細胞明顯減少、排列紊亂、細胞間隙增大。C、D組卵巢組織中空泡及閉鎖卵泡明顯減少，顆粒細胞數量增多且呈放射狀整齊排列，并開始出現各級卵泡，成熟卵泡明顯增多，可見較多排卵前的竇狀卵泡。卵巢顏色紅潤，尺寸增大，透明度好，整體來看與A組卵巢狀態相似(圖3)。與A組相比，B組原始卵泡、生長卵泡數量明顯減少(P<0.05)、閉鎖卵泡數量明顯增多(P<0.05)；與B組相比，C、D組生長卵泡明顯增多、閉鎖卵泡明顯減少(P<0.05)。與C組相比，D組生長卵泡數量有增加趨勢、閉鎖卵泡數量趨于減少，在21 d治療時間點兩組差異有統計學意義(P>0.05)，詳見表2。

圖3 各組小鼠卵巢組織HE染色結果Fig.3 HE staining results of ovarian tissue in each group of mice

A:control;B:POF control;C:normal hUCMSCs;D:hypoxic pretreated hUCMSCs;A1、B1、C1、D1:HE staining (10×),A2、B2、C2、D2:HE staining (40×);hUCMSCs: human umbilical cord mesenchymal stem cells;POF:premature ovarian failure;HE:hematoxylin and eosin.

GroupNumberofcasesPrimordialfolliclesGrowingfolliclesAtreticfolliclesA1573.20±6.02161.05±34.2425.40±4.38B1559.67±7.89?99.82±33.51?35.80±2.95?C1560.32±5.72143.49±25.54#20.62±2.79#D1558.43±5.05148.80±23.39#19.66±2.45#F-8.1210.899.66P-0.0470.0290.039 ?P<0.05vsgroupA;#P<0.05vsgroupB;A:control;B:POFcontrol;C:normalhUCMSCs;D:hypoxicpretreatedhUC-MSCs;hUCMSCs:humanumbilicalcordmesenchymalstemcells;POF:prematureovarianfailure.

3 討論

POI已成為威脅正常生育年齡女性生殖系統健康的最大問題之一，其發生可能與各種原因引起的始基卵泡池儲備不足、卵泡閉鎖加速、優勢卵泡募集改變、卵泡成熟障礙等有關[9-10]。近年來，采用間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)移植治療開拓了POI治療全新的方向，但大部分處于臨床前研究階段[11-13]，臨床研究鮮有報道，而且對MSC改善卵巢功能的作用機制尚不完全清楚，目前臨床尚沒有明確有效的治療措施能恢復其生殖功能。

本課題組成功建立了hUCMSCs分離培養鑒定的全套技術設備。流式技術檢測間充質干細胞表面特異性抗原CD44和CD90，不同傳代次數細胞陽性率均保持在99%水平，提示本研究中分離培養的hUCMSCs純度較高，分離和培養方法合適，符合國際細胞治療協會(International Society for Cell Therapy, ISCT) MSCs表型鑒定標準[14]。本研究采用化學治療藥物誘導的小鼠POI模型來評價正常培養下hUCMSCs及低氧預處理hUCMSCs對POI的治療作用，發現兩個治療組血中E2及AMH濃度較治療前明顯增加，說明hUCMSCs移植治療改善了卵巢早衰小鼠的卵巢內分泌水平，增加了卵巢儲備功能，從而延緩卵巢功能衰退。同時組織病理學結果證實，經hUCMSCs移植治療后，POI小鼠卵泡的數量和質量都得到一定程度的恢復，各級卵泡的比例也趨向于正常化，說明干細胞移植后促進了POI小鼠卵巢中卵泡的恢復及再生，進一步證實了hUCMSCs對POI的治療效果，與以往報道[15-16]類似。干細胞移植入體內后面臨氧分壓、炎性環境等復雜的微環境，對其存活及進一步的療效都可能產生負面的影響，而經短期低氧預處理后，干細胞會活化一些利于其適應低氧環境的信號通路，增強其可塑性、血管再生能力等，同時調控多種生長因子的分泌，以利于其存活[17-18]。本研究中低氧預處理MSC組小鼠在血漿E2及AMH濃度、生長卵泡和閉鎖卵泡數量方面，均較正常MSC治療組出現對療效更有利的趨勢，這也在一定程度上印證了低氧預處理干細胞的優勢。

本研究為hUCMSCs治療POI進一步的臨床前研究提供了理論基礎和啟示，但在hUCMSCs促進卵泡恢復的詳細機制、移植方式、移植部位與數量、移植時間窗、移植后干細胞的歸巢、移植前對干細胞的處理和改造，以及后期臨床上卵巢功能恢復評價指標的選擇等方面，尚需要進一步的探索，以便充分發揮干細胞的治療效果。