微管相關蛋白tau轉基因細胞和動物模型的建立及tau蛋白病變表征

馬登磊 張 旭 羅 藝 黃 蕊 李雅莉 李 林 張 蘭*

(1.首都醫科大學宣武醫院藥學部，北京 100053；2.神經變性病教育部重點實驗室，北京 100053；3.北京市神經藥物工程研究中心，北京 100053；4.首都醫科大學宣武醫院中心實驗室，北京 100053)

微管相關蛋白tau(microtubule-associated protein tau，MAPT)是一種微管結合蛋白，在細胞中發揮正常的生理功能。在神經元中tau蛋白主要富集于神經元軸突內，與微管結合并調節微管的組裝與解聚，維持微管的穩定性[1]。而當tau蛋白發生異常病變時，如發生基因突變、過度磷酸化等，會引起tau蛋白的結構發生變化，無法發揮正常生理功能，并自身發生異常聚集而引起病理改變，最終導致一類tau蛋白相關疾病(tauopathy)的發生[2]。Tau蛋白病通常以tau蛋白異常磷酸化或異常聚集為特征，包括阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)、連鎖于17號染色體tau突變伴帕金森綜合征的額顳葉癡呆(frontotemporal dementia with Parkinsonism linked totaumutations on chromosome 17，FTDP-17)、皮質基底節變性等[3]。

在tau蛋白相關研究[4]中，tau轉基因動物模型可以模擬AD及其他tau蛋白病的一些疾病特征，被廣泛應用于相關疾病的病理機制研究及藥物研發中。在FTDP-17患者家系中發現了tau基因突變，P301位點導致的突變會引起患者出現癡呆為主的臨床表現[5]。因此，以P301L和P301S突變tau蛋白轉基因模型可以模擬AD及其他tau蛋白病(tauopathy)的一些疾病特征，例如tau蛋白的磷酸化和病理性沉積、神經元死亡、認知功能障礙等[6-7]。而目前在國內，tau蛋白相關的疾病模型尚較少，因此本研究擬通過建立細胞和動物的轉P301S/L模型，并觀察其tau蛋白病理改變，進而為基于tau蛋白模型的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 模型的構建

1.1.1 P301S/L質粒的構建

由南通大學劉飛教授惠贈的tau40質粒進行點突變。其中tau40質粒：PCI-neo，酶切位點：sal1+not1，表達最長人源tau基因(tau441，2N4R; NCBI序列號: NM_005910.5)，和一個HA的標簽。突變的位點是位于exon10上面的301號脯氨酸(對應的堿基序列是901～903：CCG)：其中P301S將CCG突變成TCG；P301L將CCG突變成CTG。

點突變引物設計：Mut-P301S-up：5′-ATAATATCAAACACGTCTCGGGAGGCGG-3′，Mut-P301S-down：5′-AGACGTGTTTGATATTATCCTTTGAGCCACA-3′，Mut-P301L-up：5′-TAATATCAAACACGTCCTGGGAGGCGGC-3′，Mut-P301L-down：5′-AGGACGTGTTTGATA TTATCCTTTGAGCCAC-3′。

1.1.2 P301L轉基因小鼠的繁育

rTg4510[即Tg(Camk2a-tTA)1Mmay+Tg(tetO-MAPT*P301L)#Kha/J小鼠]轉基因小鼠由Tg(tetO-MAPT*P301L)#Kha/J轉基因小鼠和Tg(Camk2a-tTA)1Mmay轉基因工具小鼠配種，得到的陽性F1代[8]。其中Tg(tetO-MAPT*P301L)#Kha/J由北京理工大學慶宏教授惠贈(購自The Jackson Laboratory，批號:015815)。B6;CBA-Tg(Camk2a-tTA)1Mmay/JNju小鼠購自南京大學-南京生物醫藥研究院,實驗動物許可證號：SCXK(蘇) 2015-0001。轉基因小鼠由Tg(tetO- MAPT*P301L)#Kha/J轉基因小鼠和Tg(Camk2a-tTA)1Mmay轉基因工具小鼠配種，F1代中兩個基因型均為陽性的小鼠為表達P301L-tau蛋白的rTg4510轉基因陽性小鼠。

1.1.3 P301S轉基因小鼠的繁育

由B6;C3-Tg(Prnp-MAPTP301S)PS19VleJnju轉基因小鼠與C57BL/6J野生型小鼠交配，得到F1代，進行基因鑒定為陽性的即為PS19-P301S轉基因突變小鼠[9]。

1.2 動物飼養

動物飼養于屏障環境中。采用12 h/12 h晝夜間斷照明，飼養溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，自由進食飲水。繁育期間定時觀察小鼠情況，記錄仔鼠的出生日期、只數等，并于出生后14 d左右剪腳趾編號，21 d進行離乳和雌雄分籠。新生仔鼠的編號剪下的腳趾用于基因型鑒定。使用KAPA快速基因分型試劑盒進行基因分型(KAPA Biosystems公司，美國)。

1.3 細胞轉染

人胚胎腎細胞HEK293T于5%(體積分數) CO2、37 ℃培養箱內進行培養，每2～3 d更換1 次含10%(體積分數)胎牛血清的DMEM完全培養基。細胞生長至足夠豐度時，將105個/mL細胞接種于12 孔培養板中；24 h后更換新鮮的完全培養基，用Polyplus轉染試劑進行轉染，質粒DNA∶轉染試劑=1 μg∶2 μL，放人培養箱繼續培養； 24 h后更換新鮮的完全培養基，繼續培養24 h后，使用超聲細胞粉碎機超聲，裂解細胞提取蛋白。

1.4 實驗分組

本研究的細胞模型部分，分別在HEK293細胞中轉染不同的質粒，過表達相關的基因，分為空載體組(vector)、野生型tau蛋白(tau40)、P301L突變tau蛋白(P301L)和P301S突變tau蛋白(P301S)細胞模型組。在動物模型部分，本研究應用了P301L轉基因小鼠組(rTg4510)及同籠對照小鼠(nTg-1)，P301S轉基因小鼠組(PS19)及同籠對照小鼠組(nTg-2)，7月齡時分別取各組小鼠(n=3)做免疫組織化學實驗，11月齡時取各組小鼠(n=4)進行蛋白表達檢測。

1.5 動物組織的取材

1.5.1 新鮮組織裂解

待轉基因小鼠飼養到11月齡時，分別取轉基因陽性鼠rTg4510和PS19小鼠及相應的轉基因陰性小鼠的大腦皮質，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液裂解勻漿，超聲裂解后室溫靜置30 min，4 ℃離心機以12 000 r /min 的轉速離心15 min 后取上清，測定各組中蛋白的濃度。加入蛋白上樣緩沖液，95 ℃變性5 min，得到蛋白樣本用于Western blotting法檢測。

1.5.2 固定組織取材及冰凍切片

分別取7月齡的轉基因陽性鼠rTg4510和PS19小鼠及相應的轉基因陰性小鼠，麻醉后分別灌注0.9%(質量分數)氯化鈉注射液及4%(質量分數)多聚甲醛固定液。固定后取出腦組織，脫水后在冰凍切片機(620E，購自美國Thermo公司)中行冠狀位冰凍切片，切片厚度分別為30 μm。

1.6 Western blotting 法檢測蛋白表達

將等量蛋白上樣樣本按順序緩慢勻速加入丙烯酰胺凝膠的孔中，恒壓100 V 電泳、恒壓90 V電轉120 min，將蛋白轉移到PVDF膜上，5%(質量分數)脫脂奶粉封閉(室溫，2 h)，一抗tau5抗體(識別總tau蛋白，1∶1 000，購自德國Calbiochem公司)，pS199/202抗體(識別Ser199/202位點磷酸化的tau，1∶1 000，購自美國Invitrogen公司)，PHF-1抗體(識別Ser399/404位點磷酸化的tau，1∶1 000，購自美國Abcam公司)，pS396抗體(識別Ser396位點磷酸化的tau，1∶1 000，購自美國Invitrogen公司)，pS404抗體(識別Ser404位點磷酸化的tau，1∶1 000，購自美國Invitrogen公司)，內參抗體GAPDH(1∶1 000，購自美國CST公司)；一抗4 ℃孵育過夜后，二抗室溫孵育2 h，隨后TBST洗膜3次。在化學凝膠成像系統(Flour ChemHD2)中，加入化學發光液(購自德國Millipore公司)，得到合適的曝光條帶，進一步進行蛋白半定量分析。

1.7 免疫組織化學及免疫熒光法

冰凍切片提前切片于載玻片上，10%(體積分數)血清封閉。室溫封閉2 h后，孵育一抗β-(Ⅲ)-tubulin(1∶200，美國CST公司)AT8(識別Ser202/205位點磷酸化的tau，1∶1 000，美國Thermo公司)，一抗用抗體稀釋液稀釋，4 ℃過夜。PBST洗去一抗后，免疫組織化學法孵育免疫組織化學二抗及三抗。PBST漂洗后用DAB顯色液進行顯色(中杉金橋公司)。脫水，中性樹膠封片，并在顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察。免疫熒光法則孵育熒光二抗，用含DAPI的封片劑封片，并在熒光顯微鏡下觀察。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 過表達tau40、P301L和P301S細胞模型中tau蛋白表達

在HEK293細胞中分別轉入等量的空質粒(vector)，以及分別含有tau40、P301L和P301S突變tau的質粒。Western blotting法檢測結果顯示(表1)，轉染tau40、P301L和P301S的HEK293細胞均過表達了總tau蛋白，與空質粒組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，而各組間差異無統計學意義(P>0.05)。進一步檢測了主要的tau蛋白磷酸化位點(與總tau相比較得到相對tau蛋白的磷酸化水平)，絲氨酸199/202以及396/404位點的磷酸化水平在轉染tau40、P301L和P301S，均顯著高于空質粒組(P<0.05)，其中P301S的在這些位點的磷酸化水平要高于tau40和P301L組,詳見表1、圖1。

2.2 過表達tau40、P301L和P301S對HEK293細胞骨架形態的影響

本研究應用β-tubulin識別細胞微管。與空質粒組相比，過表達tau蛋白的細胞微管形態均發生了改變，未均勻分布在細胞質中，發生了收縮或聚集，且在P301L和P301S組中尤其明顯(圖2)。

2.3 P301L和P301S轉基因小鼠中tau蛋白及磷酸化tau蛋白的表達

取11月齡轉基因小鼠的腦組織進行Western blotting檢測，與轉基因陰性小鼠相比，轉基因陽性小鼠tau蛋白表達均顯著增加(P<0.01)，而且rTg4510小鼠的tau蛋白表達量也顯著高于PS19小鼠(P<0.05，圖3)。進一步檢測tau蛋白磷酸化水平(與總tau相比較)，轉基因陽性鼠在絲氨酸199/202、396、404位點的磷酸化水平均顯著高于轉基因陰性小鼠(P<0.05)，其中絲氨酸199/202、396磷酸化水平rTg4510小鼠略高于PS19小鼠，絲氨酸404位點的磷酸化水平rTg4510小鼠略低于PS19小鼠，詳見表2。

GroupNumberofcasesTau5pS199/202pS396/404Vector30.13±0.010.22±0.050.11±0.05Tau4031.56±0.02??1.00±0.13?1.00±0.17?P301L31.57±0.16?1.03±0.02?1.24±0.23?P301S31.54±0.11?1.48±0.34?1.42±0.04??F49.7208.0405.250P0.0010.0090.027 ?P<0.05,??P<0.01vsvectorgroup.

圖1 Western blotting法檢測HEK293細胞中轉染tau40、P301L和P301S質粒后tau蛋白及磷酸化tau的表達Fig.1 Western blotting for tau and relative level of phosphorylated (p)-tau in tau40/P301L/P301S-plasmid transfected HEK293 cells

圖2 HEK293細胞中轉染tau40、P301L和P301S質粒后微管形態的變化Fig.2 Changes of microtubules in tau40/P301L/P301S-plasmid transfected HEK293 cells (Scale bar=20 μm)

Representative images of immunofluorescence staining for β-tubulin labeled microtubules.

圖3 Western blotting法檢測tau蛋白轉基因小鼠皮質tau蛋白及磷酸化tau的表達Fig.3 Western blotting for tau and relative level of phosphorylated (p)-tau in tau transgenic mice models

nTg-1:negative transgenic control of rTg4510 mice;nTg-2:negative transgenic control of PS19 mice;PS19:transgenic mice model for P301S tau.

2.4 P301L和P301S轉基因小鼠中磷酸化tau蛋白免疫組織化學染色

應用AT8抗體(識別Ser202/205位點磷酸化的tau蛋白)利用免疫組織化學的方法檢測tau蛋白病理情況。在8月齡的rTg4510小鼠和PS19小鼠的內嗅皮質區域均顯示了AT8抗體的陽性。其中rTg4510小鼠的陽性細胞數量要多于PS19小鼠該區域的陽性細胞數量(圖4)。

GroupNumberofcasesTau5pS199/202pS396pS404nTg-140.29±0.040.43±0.060.32±0.050.37±0.11rTg451041.00±0.13??#1.00±0.10??1.00±0.13??1.00±0.17?nTg-240.20±0.010.28±0.050.29±0.050.61±0.06PS1940.65±0.03##0.79±0.12##0.81±0.05##1.24±0.15##F29.1914.5020.569.41P0.0010.0010.0010.002 nTg-1:negativetransgeniccontrolofrTg4510mice;nTg-2:negativetransgeniccontrolofPS19mice.PS19:transgenicmicemodelforP301Stau;?P<0.05,??P<0.01vsnTg-1group;##P<0.01vsnTg-2group;#P<0.05vsPS19group.

圖4 Tau蛋白轉基因小鼠皮質AT8免疫組織化學染色Fig.4 Immunohistochemistry staining of AT8 in the entorhinal cortex of tau transgenic mice models (Scale bar=100 μm)

Representative images of Immunohistochemistry staining of AT8 (against PHF-tau at Ser202/205) in the entorhinal cortex of tau transgenic mice models.nTg-1:negative transgenic control of rTg4510 mice;PS19:transgenic mice model for P301S tau;nTg-2:negative transgenic control of PS19 mice；PHF:paired helical filaments.

3 討論

在AD等神經系統疾病的研究中，tau蛋白受到了越來越多的關注，tau蛋白相關的機制研究和以tau蛋白為靶點治療AD及tau蛋白相關疾病成為國內外研究的熱點。在tau蛋白在AD等相關疾病中的機制研究中發現，tau蛋白的過度磷酸化是導致病理改變最重要的原因[10]。tau蛋白的磷酸化主要通過兩個方面影響正常的生理功能。一方面tau蛋白的過度磷酸化可以降低tau蛋白與微管的正常結合，引起tau蛋白與微管結合能力降低和微管的解體[11]。另外一方面，tau蛋白從微管解離可以引起細胞內游離tau蛋白增加，而過度磷酸化的tau蛋白則可以進一步促進游離tau蛋白的異常聚集[12]。Tau蛋白發生異常聚集后可以進一步損傷微管和軸漿運輸，影響細胞的正常生理功能[13]。

本研究分別應用國際上比較認可的tau蛋白轉基因動物模型，rTg4510轉基因小鼠(過表達～13倍于內源性tau 的人P301L突變的4R0N-tau蛋白)以及PS19轉基因小鼠(過表達3～5倍于內源性tau的人源P301L突變4R1N-tau蛋白)。首先在細胞模型中過表達了tau及P301位點突變的tau蛋白，引起tau蛋白水平以及tau蛋白磷酸化水平的增加，同時也導致微管的形態發生了改變，提示了過表達tau蛋白引起的tau蛋白過度磷酸化可能通過影響了微管的形態和生理功能，發揮毒性作用。同時，表達突變tau蛋白的細胞內磷酸化水平及微管病變與野生型tau蛋白略有差異，提示突變tau蛋白可能會產生更大的毒性作用。突變tau蛋白會引起tau蛋白構象等改變，進而導致tau蛋白更易發生聚集或形成纏結，進而產生tau蛋白病變[14]。因此，多個tau突變被用于構建動物模型，模擬tau蛋白引起的病理改變，其中以P301L/S突變構建的轉基因小鼠模型種類較多，表型相對明顯[15]。與之前研究[8]報道結果一致，本研究中rTg4510小鼠可以過表達tau蛋白，顯著高于對照組內源tau的表達。同時，PS19小鼠tau蛋白表達量也顯著高于對照小鼠，且低于同月齡的rTg4510小鼠，這也與PS19過表達tau蛋白的量較低的報道[9，16-17]是一致的。在本研究檢測的磷酸化位點中，轉基因小鼠的磷酸化水平均顯著高于轉基因陰性小鼠，但是不同位點的相對磷酸化水平的高低兩個小鼠略有差異，提示不同的突變類型可能造成不同位點的磷酸化水平產生差異。

綜上所述，本研究通過構建并表征了3個過表達tau及突變tau蛋白的細胞模型，繁育并檢測了兩個突變tau蛋白轉基因小鼠模型。并通過檢測tau蛋白表達、tau蛋白磷酸化的水平以及微管的形態等初步比較了不同模型間的差異。通過本研究得到的結果，能夠為tau蛋白及tau蛋白相關疾病的研究提供了可選擇的病理模型。