子宮內膜異位癥原代細胞培養及纖維化相關蛋白檢測

張艷芹 吳 迪 鄧夢琪 常翔宇 苗勁蔚

(首都醫科大學附屬北京婦產醫院婦瘤科，北京 100006)

子宮內膜異位癥 (endometriosis，EMs)是指子宮內膜腺體和基質異位到宮腔以外的部分，以卵巢、子宮直腸陷凹、子宮骶韌帶等部位最常見，是生育期女性常見病、多發病，發病率高達7%～10%[1]。EMs患者中更是高達50%伴有不孕或盆腔疼痛[2]。EMs患者的異位病灶與正常在位子宮內膜相似有明顯的激素依賴性，就EMs發病的侵蝕性、復發性和激素依賴性特征又與惡性腫瘤的生長有很大的相似性。目前關于EMs發病有經血逆流、 體腔上皮化生等多種學說，其中以經血逆流學說最被接受[3]。然而研究[4]證明90%的育齡期女性都存在經血逆流現象，只有10%～15%的女性發病。可見經血逆流可能是EMs發病的重要誘因，但不是發病的決定因素。EMs不僅發病率高，而且治療棘手，手術治療后5年復發率高達50%[5]。更為嚴重的是近年來EMs纖維化患者特定類型卵巢癌的發病率較正常育齡期女性有明顯的上升，目前研究[6]顯示EMs的基本病變為異位的子宮內膜組織在雌激素的作用下周期性剝脫，出血并被其周圍組織包裹繼而發生纖維化，形成異位結節最終形成盆腔粘連，因而導致慢性盆腔疼痛、不孕、月經異常等一系列癥狀。為探索EMs發病的基礎以及EMs纖維化與盆腔疼痛及不孕的關系，針對EMs發病及進展的基礎醫學研究成為EMs研究的重點。目前關于EMs纖維化的研究有建立永生化細胞系和內膜異位細胞原代培養兩種方法。但無論是通過癌細胞誘導還是基因水平改變建立EMs纖維化細胞系，其代表性都遠低于EMs細胞原代培養。因此本實驗采用改進的EMs原代細胞分離方法，分離出EMs間質細胞。并使用分子生物學方法檢測原代細胞纖維化相關蛋白的表達水平。探究EMs 異位子宮內膜間質細胞與EMs在位及正常在位子宮內膜間質纖維化相關蛋白表達的差異。

1 材料與方法

1.1 標本采集

收集2017年9月-2018年9月于首都醫科大學附屬北京婦產醫院行手術治療的EMs患者共12例及非子宮腺肌癥子宮肌瘤患者9例。患者年齡22～48歲。所有患者術前未接受過激素類藥物治療，無其他女性生殖系統相關內分泌、代謝、免疫疾病。無惡性腫瘤病史。入院時心、肺、肝、腎等功能檢查無明顯異常。該研究經過首都醫科大學附屬北京婦產醫院倫理委員會批準，倫理審批號：2018-KY-002-01。入選患者均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器

CO2細胞培養箱 (美國 Thermo Fisher Scientific公司) 、超凈細胞工作臺 ( 美國 Thermo Fisher Scientific公司)、微量可調移液槍(法國Glison公司) 、Eclipse TS100-F倒置光學顯微鏡 ( 日本 Nikon 公司) 、MULTIFUGE X3R 臺式離心機(美國 Thermo Fisher Scientific公司) 和Precision GP 10 型水浴鍋( 美國 Thermo Fisher Scientific公司)、不銹鋼細胞篩直徑74 μm，200目/150 μm，100目(南京公路牌)、免疫熒光顯微鏡(日本 Nikon公司)。

1.3 主要試劑

1∶1 DMEMs-F12培養基(美國Hyclone公司)，標準胎牛血清(美國Life公司)、1×PBS溶液(北京索萊寶公司)、 Ⅳ型膠原酶(美國Sigma公司)；0.25%(質量分數)胰蛋白酶-EDTA溶液(北京索萊寶公司)、鼠抗人波形蛋白(美國CST公司，D21H3)、兔抗CTGF抗體(美國CST公司，D8Z8U)、兔抗COL1A1抗體(美國CST公司，#84336)及兔抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體(美國CST公司,D4K9N)、青鏈霉素(北京索萊寶公司)。

1.4 原代細胞分離培養

在嚴格無菌條件下，取新鮮EMs在位、異位及正常人子宮內膜組織，立即放入冰盒運輸至實驗室(從組織離體至細胞分離在2 h之內完整)。根據文獻[7-8]所提供的EMs原代細胞培養方法進行不斷實踐及改進，通過新的實驗方案對EMs子宮內膜間質細胞進行原代分離。具體分離操作：(1)在超凈工作臺內使用PBS將新鮮組織沖洗3次，清洗掉組織上的血液及巧克力囊液。(2)將組織分為兩份，一份用組織標本固定液保存，用免疫組織化學法檢測，另一部分放入6 cm細胞培養皿，用眼科剪剪成0.5～1.0 mm碎塊，肉眼觀呈糊狀。(3)加入3倍體積已經預加溫至37 ℃的0.25%(質量分數)Ⅳ型膠原酶-胰蛋白酶EDTA混合溶液，混勻置于37 ℃細胞培養箱中消化5～10 min，消化過程中不斷吹打混勻。(4)消化后置于150 μm，100目細胞濾過網過濾。(5)將濾過液加入2倍體積的含10%(體積分數)FBS及1%(體積分數)1× PS雙抗的1∶1 DMEMs-F12細胞培養基終止消化。(6)過濾后的上層組織回收至6 cm細胞培養皿再次加入3倍體積的預加溫至37 ℃的0.25%(質量分數)Ⅳ型膠原酶-胰蛋白酶EDTA混合溶液繼續消化10～15 min。同樣重復上述步驟，將消化結束后的液體通過150 μm，100目細胞濾過網，過濾液加入2倍體積含FBS的完全培養液終止消化。(7)將所有濾過液收集一起，通過74 μm，200目細胞濾過網。(8)將過濾后的細胞懸著液轉移入50 mL離心管中，700 r/min離心3 min，移除上清液(此處可保留1 mL離心后的細胞懸浮液，增加細胞回收數量)。(9)加入10%(體積分數)FBS及1%(體積分數)1×PS雙抗的1∶1 DMEMs-F12細胞培養基，吹打成均勻的細胞懸液。以細胞密度為1×105/mL，接種于25 cm2的培養瓶中，置37 ℃、5%(體積分數)CO2培養箱中培養。(10)24 h即可觀察間質細胞貼壁，48 h后換液，棄除未貼壁細胞，加入新鮮的完全培養基繼續培養，以后每2～3 d換液一次。待細胞生長密度達80%～90%時即可用0.25%(質量分數)胰蛋白酶-EDTA消化傳代。傳代后細胞生長良好，6代內細胞形態及生長速度無明顯變化。一般原代培養子宮內膜間質細胞8～10 d可長滿，傳代后細胞2～4 d即可長滿。

1.5 間質細胞性質鑒定

通過普通免疫組織化學方法及熒光免疫組織化學法檢測細胞爬片中波形蛋白(vimentin)的表達。(1)免疫組織化學法：將無菌的載玻片放入細胞培養皿中，制作細胞爬片，使用波形蛋白(vimentin) 1∶100濃度4 ℃孵育過夜，山羊抗兔二抗1∶200濃度37 ℃溫箱30 min，DAB顯色劑顯色，光鏡下觀察。(2)免疫熒光法：同樣是首先制作細胞爬片，使用波形蛋白(vimentin) 1∶100濃度4 ℃孵育過夜，后期使用647標記山羊抗兔IgG 1∶500濃度，37 ℃溫箱30 min，PBS沖洗3次，DAPI染核10 min，熒光顯微鏡拍照，熒光染色后操作均需避光。

1.6 組織水平檢測纖維化相關蛋白表達

對臨床獲取的EMs在位、異位以及正常人在位子宮內膜，做組織水平纖維化相關蛋白CTGF、α-SMA、Collagen α(1)的表達水平。具體方法：組織石蠟包埋切片，CTGF、α-SMA、Collagen α(1)一抗1∶100濃度4 ℃ 過夜，KPL山羊抗兔二抗1∶200 37 ℃溫箱30 min，DAB顯色劑顯色，光鏡下觀察。

使用蛋白免疫印跡法檢測細胞水平纖維化相關蛋白的表達，具體方法：將細胞收集進行蛋白提取BCA定量，制作等蛋白量點樣液跑膠，不封閉。5%(體積分數)BSA-TBST稀釋一抗1∶1 000在4 ℃孵育過夜，5%(體積分數)BSA-TBST稀釋二抗，山羊抗兔IgG(H+L)HRP 1∶10 000，室溫孵育 40 min。洗膜顯影。

使用蛋白免疫印跡法檢測得到組織及細胞水平纖維化相關蛋白的表達條帶，圖片掃描后，使用軟件Gel Image ststem Ver. 4.00，對條帶灰度進行分析，得到以β-actin為基線的纖維化相關蛋白表達結果比值，進一步對組織及細胞水平纖維化相關蛋白的表達水平做對比。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 EMs原代細胞培養結果

共收集培養12份內異癥異位及在位子宮內膜組織，9份正常人子宮內膜組織，EMs在位間質細胞原代分離成功12例，成功率為100%。EMs異位組織分離培養12列成功11例，成功率為91.7%。正常人子宮內膜組織分離9例成功8例，成功率為88.9%。EMs異位組織分離培養失敗的1例是因為操作時間過久引起細菌污染。正常人子宮內膜組織分離培養失敗的1例是由于首次分離摸索條件時消化過度，細胞死亡。普通光學顯微鏡下細胞貼壁生長，形態呈三角梭形，細胞核圓形居中。3組細胞形態學無明顯差異，培養結果見圖1。

2.2 原代提取細胞波形蛋白(vimentin)鑒定結果

3組原代培養的間質細胞vimentin表達明顯，改良后原代EMs間質細胞提取方法能夠成功提取出間質細胞，詳見圖2。

2.3 EMs異位、在位及正常人在位子宮內膜組織中纖維化相關蛋白表達差異

EMs異位組織中纖維化相關蛋白CTGF、α-SMA、Collagen α(1)的表達較EMs在位及正常人子宮內膜明顯增高，而EMs在位組織與正常人子宮內膜纖維化相關蛋白的表達無明顯差異。普通免疫組織化學可見淡藍色橢圓形為細胞核，棕色為相關蛋白的表達水平。可以看出子宮內膜異位組織中纖維化相關蛋白的表達明顯高于子宮內膜在位及正常人子宮內膜組織(圖3)。

圖1 光學顯微鏡下觀察原代細胞形態及大小Fig.1 Morphology of primary cells under light microscope (Scale bar=50 μm)

圖2 免疫組織化學及免疫熒光檢測間質細胞波形蛋白表達結果Fig.2 Detection of vimentin expression in mesenchymal cells by immunohistochemistry and immunofluorescence(Scale bar=25 μm)

HEnESCs：human normal endometrial stromal cells；HEcESCs：human ectopic endometrial stromal cells；HEuESCs：human eutopic endometrial stromal cells.

蛋白免疫印跡法再次檢測EMs異位、在位及正常人在位子宮內膜組織中纖維化相關蛋白表達差異，子宮內膜異位組織中纖維化相關蛋白的表達明顯高于子宮內膜在位及正常人子宮內膜組織(圖4)。

EMs患者異位病灶組織中3種纖維化相關蛋白的表達水平與EMs在位子宮內膜及正常人子宮內膜組織的差異有統計學意義，而EMs在位子宮內膜與正常人子宮內膜組織中纖維化相關蛋白的表達差異無統計學意義(表1、2)。

2.4 間質細胞中纖維化相關蛋白的表達與組織水平存在一致性

2.4.1 經過蛋白免疫印跡定量檢測

EMs患者異位病灶間質細胞纖維化相關蛋白的表達與EMs在位及正常人子宮內膜間質細胞纖維化相關蛋白的表達差異有統計學意義(P<0.05)，通過Bland-Altman方法分析組織及細胞水平纖維化相關蛋白差異一致性，組織與細胞水平纖維化相關蛋白的表達存在一致性(圖5)。

2.4.2 統計分析組織水平

HEcESCs中纖維化相關蛋白的表達水平與HEuESCs及HEnESCs兩組細胞中纖維化相關蛋白的表達水平，差異有統計學意義(P<0.05)。而HEuESCs與HEnESCs兩種細胞種纖維化相關蛋白的表達差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表3、4。

3 討論

EMs作為育齡期女性的常見病、多發病，其生物學特征至今仍不明確。多種發病學說中經血逆流學說較為經典并廣為接受[3]。由于經血逆流普遍存在于在育齡期婦女，但只有少數發展為EMs。針對這一現象目前又有不同的觀點，一種觀點[9-10]認為EMs患者在位子宮內膜細胞的特性有關，逃脫了免疫監視和清除而得以在盆腔內種植。 另一種觀點[11-12]認為是EMs患者免疫系統出現異常，無法清除正常的逆流經血。本實驗通過改良EMs原代細胞培養方法培養子宮內膜間質細胞，簡化了EMs原代培養的步驟，同時保證了較高培養成功率。本實驗在EMs原代細胞培養的基礎上檢測3組細胞及相應組織中纖維化相關蛋白的表達。結果顯示，EMs患者異位病灶組織及間質細胞CTGF、α-SMA、Collagen α(1)的表達明顯高于EMs在位及正常人子宮內膜組織及間質細胞，而EMs在位內膜組織及間質細胞與正常人子宮內膜組織及間質細胞纖維化相關蛋白的表達水平差異無統計學意義。同時本研究發現EMs在位組織與細胞纖維化相關蛋白表達水平較EMs異位組織及細胞有較大差異，該結果提示EMs患者在位子宮內膜在異位到宮腔外前并沒有表現出纖維化的特征，異位后的子宮內膜在異位部位各種條件的誘導下，發生纖維化，引起了慢性盆腔痛、女性不孕等一系列癥狀，因此異位后的子宮內膜在異位部位發生纖維化過程值得進一步探討。關于EMs纖維化的具體分子學發生機制目前尚未明確，本課題組將繼續對其分子水平的演變過程進行進一步研究。EMs原代細胞培養困難，分離培養過程盡可能滿足以下幾點 ：(1)取材：盡可能選擇新鮮內膜異位囊腫，組織獲取后冰盒轉運，立刻送往實驗室分離培養。(2)操作：首先取材操作過程中注意無菌原則。組織剪碎過程要盡可能迅速，操作時間延長將提高污染的風險。組織要盡可能剪碎，大塊組織需要延長消化時間，增加消化酶對細胞的損傷。組織消化時間不宜過長，可適當增加消化次數。(3)培養：首次培養培養基內可加入5%(體積分數) 1×PS雙抗減少污染。原代培養的EMs間質細胞傳代培養6代內能穩定生長。本實驗對以往的培養方法加以驗證及改進，摸索出一種簡單、實用的EMs原代細胞分離方法。改進后優點：(1)以往以膠原酶和DNaseⅠ混合消化方法，操作步驟繁多，操作時間長，增加了污染機會，本實驗所有消化液一次性按比例混合，減少污染。(2)以往分離方法價格昂貴，加大了相關實驗的經費支出，本實驗采用0.25%(質量分數)Ⅳ型膠原酶-胰蛋白酶-EDTA混合液作為消化液，不使用DNA酶，大幅度降低操作成本。(3)本實驗保持較高成功率，為后期EMs相關實驗提供好的基礎。本實驗，證明了EMs異位病灶組織及間質細胞纖維化水平明顯高于EMs在位及正常人子宮內膜。明確EMs異位病灶有明顯的纖維化，異位病灶原代分離的間質細胞與組織水平纖維化相關蛋白的表達存在一致性。為后期EMs相關研究提供突破口及進一步設計實驗提供基礎。

圖3 免疫組織化學檢測子宮內膜在位、異位及正常子宮內膜組織水平纖維化相關蛋白CTGF，α-SMA 及Collagen α(1)的表達水平Fig.3 Expression levels of fibrosis-associated proteins CTGF，α-SMA and collagen1 in the eutopic，ectopic of EMs and normal endometrial tissues of the endometrium detected by immunohistochemistry(Scale bar=50 μm)CTGF：connective growth factor；α-SMA：α-smooth muscle actin;EMs：endometriosis.

圖4 蛋白免疫印跡檢測子宮內膜在位、異位及正常子宮內膜組織水平纖維化相關蛋白CTGF，α-SMA 及Collagen α(1)的表達水平Fig.4 Expression levels of fibrosis-associated proteins CTGF，α-SMA and Collagen α(1) in eutopic，ectopic of EMs and normal endometrial tissues of the endometrium by Western blottingCTGF：connective growth factor；α-SMA：α-smooth muscle actin;EMs：endometriosis.

ProteinEMsectopicEMseutopicControlF/HPCollagenα(1)/actin0.449±0.0580.264±0.0580.231±0.11510.8030.005α-SMA/actin0.546±0.1160.331±0.0970.310±0.07219.593<0.001CTGF/actin0.405±0.0940.231±0.0530.220±0.07911.3640.003 EMs:endometriosis;CTGF:connectivegrowthfactor;α-SMA:α-smoothmuscleactin.

表2 組織水平蛋白表達差異兩兩比較Tab.2 Protein expression differences in two pairs at the tissue level

圖5 蛋白免疫印跡檢測子宮內膜在位、異位及正常人子宮內膜細胞水平纖維化相關蛋白CTGF，α-SMA 及Collagen α(1)的表達水平Fig.5 Expression levels of fibrosis-related proteins CTGF，α-SMA and Collagen α(1)in eutopic，ectopic of EMs and normal endometrial cells detected by Western blotting

ProteinControlEMsectopicEMseutopicFPCollagenα(1)/actin0.226±0.0690.621±0.1080.293±0.12533.574<0.001α-SMA/actin0.300±0.1810.595±0.0490.286±0.14812.845<0.001CTGF/actin0.284±0.1210.470±0.0630.273±0.10310.1060.001 EMs:endometriosis;α-SMA:α-smoothmuscleactin;CTGF:connectivegrowthfactor.

表4 細胞水平蛋白表達差異兩兩比較Tab.4 Protein expression differences in two pairs at the cellular level