外源NO對NaCl脅迫下紅砂幼苗生長和生理特性的影響

賈向陽, 種培芳, 張玉潔, 李 毅, 蘇世平

(甘肅農業大學林學院， 甘肅 蘭州 730070)

一氧化氮(Nitric Oxide,NO)是動植物體中一種普遍存在的生物活性分子[1]，廣泛參與植物對逆境脅迫的應答過程，如清理鹽害[2]所引起的MDA和O2-積累減輕鹽害作用、誘導植物體內的抗氧化酶活性來有效緩解極端溫度[3]所導致損傷、改善植物的光合作用和生長發育來提高對干旱脅迫[4]的適應性等。植物在遭受逆境條件下自身會通過一氧化氮合酶和硝酸還原酶催化等途徑產生NO。大量研究表明，NO在參與植物逆境應答中具有雙重生理效應，高濃度NO具有協同加劇鹽脅迫的作用，而處于低濃度狀態時NO能夠緩解鹽害[2,5-7]。硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)又名亞硝基鐵氰化鈉，是外源NO的直接供體，研究發現，0.5 mmol·L-1SNP在水中可釋放約2.0 μmol·L-1NO[8]。當NO處于低濃度狀態時(<0.10 mmol·L-1SNP)能夠增強海邊月見草(OenotheradrummondiiHook)的保水能力[5]；促進玉竹(Polygonatumodoratum(Mill.) Druce)幼苗可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸合成[7]，延緩黃瓜(CucumissativusL)葉片中MDA和H2O2積累[9]，減輕鹽脅迫誘導的膜脂過氧化損傷[10]，在玉米(Zeamays)幼苗對離子選擇吸收方面表現促K+抑Na+的現象[11]等。同時，NO(<10 μmol·L-1SNP)可以通過增強日本晴水稻(OryzasativaL.japonica.cv.Nipponbare)幼苗的抗氧化系統進而提高植物的耐鹽性[12]?？梢钥闯?，近年來應用NO調控植物逆境脅迫的研究比較廣泛。

紅砂(Reaumuriasoongorica)是我國荒漠地區分布最廣泛的半灌木，主要分布在荒漠和半荒漠山前平原、山地丘陵和戈壁等環境下，是這一地帶的優勢種和建群種，在鹽堿地改良、防風固沙及保護綠洲等方面具有重要的生態價值[13]，同時在草原化荒漠和典型荒漠地區常被牧民作為牲畜的飼料[14-15]。紅砂具有一定的耐鹽性，其建群或共建群落主要分布在總鹽量在0.5%～2.0%的荒漠地帶鹽漬化土壤上[16-17]，鹽分在一定程度上抑制了其生長，以初生代謝的生物量是評價其耐鹽性的重要指標。近年來，利用可溶性小分子脯氨酸[18]對蛋白質的保護作用，信號分子水楊酸[19]誘導物體內相關蛋白基因表達，生長素[20]調控特定基因的表達等外源物質對植物耐鹽機理的研究比較廣泛，如牛宋芳等[21]發現生長素之一的赤霉素可以促進鹽脅迫下紅砂種子的萌發，而有關NO調控紅砂耐鹽機理方面的研究至今尚未報道。本研究以硝普鈉(SNP)為NO供體,通過研究不同濃度梯度外源NO對鹽脅迫下紅砂生長、離子含量、有機滲透物質動態及質膜氧化程度的影響，來探討NO對紅砂在鹽脅迫下的生理響應機制，以期為NO提高植物耐鹽性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

本實驗在甘肅農業大學校園科研基地四周通風順暢且透光良好的人工遮雨棚內進行，紅砂種子2016年10月采自武威民勤老虎口(102°58′E，38°44′N)以0.03% H2O2消毒30min，多次漂洗干凈后播撒(2017年4月1日)于預先滅菌(防止病菌和蟲害)處理的土壤(采自民勤紅砂種源采集地灌木林生長的0～20 cm土層，土壤PH值為7.85，有機碳8.82 g·Kg-1，全氮含量為0.47 g·Kg-1，全磷0.25 g·Kg-1，全鉀0.12 g·Kg-1，鈉0.76 g·Kg-1，土壤去雜后同泥炭土和珍珠巖按3:1:1混合均勻進行改良，每盆稱取干土重量1.300 Kg)，花盆(口徑17 cm，高15 cm，底徑12 cm)中，在自然光照下幼苗頂部長至5-6枚簇生葉時疏苗，每盆保留3株。2017年7月2日選擇株高為10±1cm的苗木用于實驗處理，CK和鹽溶液用1/2 Hoagland營養液配制，為防止鹽分沖擊，開始采取遞增50 mmol·L-1的NaCl澆灌，每天19:00澆灌一次，每次澆灌量為盆內土壤持水量(21.67%)的3倍，約有2/3的溶液流出，以保持盆內鹽分濃度的恒定[22]。7月7日到達溶液最終澆灌濃度后(300 mmol.L-1，此時土壤鈉21.87 g·Kg-1，全鉀0.15 g·Kg-1)在葉面噴施用提前用蒸餾水配置好的NO供體(硝普鈉，SNP)進行處理，每天早晨7:00噴施一次，每次以液滴剛剛落下為止，對照和單獨NaCl處理噴施等量蒸餾水，連續處理30天后在2017年8月7日采集紅砂莖中部的功能葉片用液氮速凍后帶回實驗室—70℃保存，及時測定各項指標。其中1/2 Hoagland營養液購自成都市科隆化學藥品有限公司，包括2 mmol·L-1KNO3，0.5 mmol·L-1NH4H2PO4，0.1 mmol·L-1Ca(NO3)2.4H2O，0.25 mmol·L-1MgSO4.H2O，0.5 mmol·L-1Fe-citrate，92 μmol·L-1H3BO3，10 μmol·L-1MnCl2.4H2O，1.6 μmol·L-1ZnSO4.7H2O，0.6 μmol·L-1CuSO4.5H2O，0.7 μmol·L-1(NH4)6Mo7O24.4H2O。每個處理6組重復，共42盆；遮雨棚內最高日溫和最低夜溫分別為(30～38℃)/(20～22℃)，相對濕度約30%～50%；具體實驗設計如表1。

表1 鹽分處理與對應的NO處理組合Table 1 Salt treatment combined with corresponding NO treatment

1.2 測定指標與方法

1.2.1 生長指標 在處理前t1和處理結束時t2分別量取紅砂的株高H1和H2，平均株高生長速率(Average Height Growth Rate，AHGR)=(H2- H1)/(t2-t1)，t2-t1的期限為30天。然后采用破壞性取樣，用去離子水將整株紅砂洗凈，用濾紙吸干表面水分，110℃殺青10 min后于75℃烘干稱重，得到每個處理下植株總干重。

1.2.2 離子含量的測定 采用H2SO4-H2O2法[23]，將烘干的紅砂植株地上和地下部分粉碎研磨后，過30目篩，稱取0.5000 g樣品放于消煮管后加入8 ml濃硫酸，蓋上彎頸漏斗在消煮爐上文火消煮，管內大量冒白煙溶液成均勻的棕黑色時，逐滴加入10滴左右H2O2搖勻后繼續消煮，煮沸5 min取下，再加入10滴左右H2O2后進行消煮，逐次逐滴減量加入H2O2，直至溶液呈無色。取下冷卻至室溫后用蒸餾水定容到100 ml容量瓶中，用烘干恒重的K2SO4和NaCl(標準純)配制一系列K+和Na+的標準溶液，在FP640型火焰光度計上測定，做標準曲線并計算植物體Na+和K+離子含量。

植株對K+的選擇性運輸系數(STK+,Na+)參照鄭青松[24]提出的公式計算：

離子選擇性運輸K+的系數STK+/Na+=根(Na+/K+)/地上部分(Na+/K+)

1.3 滲透物質及丙二醛(MDA)含量的測定

參照李合生[25]的方法測定,采用蒽酮比色法、考馬斯亮藍法和磺基水楊酸法測定可溶性糖(Soluble sugar，SS)、可溶性蛋白(Soluble protein，SP)和脯氨酸(Proline，Pro)含量，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)采用硫代巴比妥酸法。

1.4 數據處理

利用Origin2017作圖，SPSS19.0進行數據分析，不同濃度SNP處理之間采用非參數單因素方差分析,差異顯著性分析采用Duncan檢測法進行多重分析，采用皮爾遜法進行雙變量相關性分析。

2 結果與分析

2.1 NO對鹽脅迫下紅砂生長的影響

由表2方差分析結果顯示NO對NaCl脅迫下紅砂幼苗平均株高生長速率影響顯著(P<0.05)。與對照(CK)相比,單獨鹽分處理顯著(P<0.05)抑制了紅砂的株高生長速率(圖1.A)，NO與鹽分作用后，紅砂株高生長速率先降后升，其中0.10 mmol·L-1的SNP處理時效果最顯著(P<0.05)，為單獨鹽分處理的258.06%，在SNP高于0.5 mmol·L-1處理后紅砂株高變化與單獨鹽分處理未達到顯著差異。由表2方差分析結果顯示NO對NaCl脅迫下紅砂幼苗總生物量影響顯著(P<0.05)。與對照(CK)相比,單獨鹽分處理顯著(P<0.05)降低了紅砂的總生物量積累(圖1.B)，NO與鹽分作用后，紅砂株高生長速率先降后升，其中0.10 mmol.L-1的SNP處理時效果最顯著(P<0.05)，為單獨鹽分處理的267.20%，在SNP高于1.00 mmol·L-1處理后紅砂總生物量積累低于單獨鹽分處理，但并未達到顯著差異。由此可見，低濃度的NO(<0.25 mmol·L-1SNP)作用可以緩解鹽脅迫下紅砂的株高生長和生物量累積，而高濃度的NO(>0.50 mmol·L-1SNP)作用未能緩解鹽脅迫對紅砂的限制作用。

圖1 NO對NaCl脅迫下紅砂幼苗平均株高生長速率和總生物量的影響Fig.1 Effects of NO on average plant height growth rate and total biomass of R.soongorica seedings under salt stress注：不同小寫字母表示處理之間差異顯著(P<0.05)，下同Note:Different lowercase letters indicate significant difference between treatments at the 0.05level，the same as below

表2 NO對NaCl脅迫下紅砂幼苗平均株高生長速率和總生物量的方差分析Table 2 Varianceanalysis of average plant height growth rate and total biomass of R.soongorica seedlings under NaCl stress

2.2 NO對鹽脅迫下紅砂可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(SP)和脯氨酸(Pro)以及丙二醛(MDA)含量的影響

與對照相比，鹽脅迫降低了紅砂葉片中SS(圖2.A)、SP(圖2.B)和Pro(圖2.C)含量，分別下降了19.05%，3.93%和1.62%，其中SS和SP均達到顯著差異水平(P<0.05)。NO作用可顯著改變鹽脅迫下紅砂葉片中的SS，SP和Pro含量，其中SS的含量呈現先上升后下降的趨勢，在0.25 mmol·L-1的SNP處理下含量最高為單獨鹽分處理的142.86%，在1.00 mmol·L-1的SNP處理下SS含量最低為單獨鹽分處理的92.32%；而SP和Pro的變化趨勢與SS相反，兩者均在0.25 mmol·L-1的SNP處理下含量最低，分別為單獨鹽分處理下的90.37%和45.05%，高于0.25 mmol·L-1的SNP處理對紅砂葉片中SP變化不顯著，而對Pro變化顯著并在1.00 mmol·L-1的SNP處理下取得極大值0.73 ug·g-1。與對照相比，單獨鹽脅迫處理下紅砂葉片中MDA含量顯著(P<0.05)上升了13.19%。不同濃度NO與鹽分共同作用后紅砂葉片中MDA含量呈先降后升的趨勢，其中0.01～0.25 mmol·L-1的SNP作用顯著降低了MDA的含量，在SNP濃度為0.10 mmol·L-1處理下MDA含量最低，為單獨鹽分處理下的52.17%，在1.00 mmol·L-1的SNP處理下MDA含量最高并且超過單獨鹽分處理21.02%(圖2.D)。

2.3 紅砂葉片SS、SP和Pro與MDA的相關性

表3所示外源NO對鹽脅迫下紅砂葉片SS、SP和Pro與MDA的相關性系數表明，MDA同SS和SP以及Pro分別極顯著負相關(P<0.01)、相關和顯著正相關(P<0.05)；同時SS同SP、Pro分別顯著負相關(P<0.05)或極顯著負相關關系(P<0.01)，而Pro和SP極顯著正相關(P<0.01)。

SSSPPro皮爾遜相關系數Pearson correlation coefficientPR2皮爾遜相關系數Pearson correlation coefficientPR2皮爾遜相關系數Pearson correlation coefficientPR2SP—0.4750.0470.226------Pro—0.8200.0000.6820.8630.0000.745---MDA—0.7260.0010.5270.2590.2980.0670.5250.0250.276

2.4 NO對NaCl脅迫下紅砂Na+、K+含量的影響

如圖3所示，與空白對照相比，單獨鹽分處理顯著改變了紅砂地上部分和地下部分中的Na+和K+含量(P<0.05)，其中Na+和K+在地下部分中分別增加了83.69%和10.47%，地上部分中Na+含量增加了51.60%，而K+含量下降了28.25%。NO與鹽分共同作用后，Na+和K+在各部分中保持了相同的變化趨勢，其中Na+和K+在地上部分中除0.10 mmol·L-1的SNP處理上升之外呈先降后升的變化趨勢，而在地下部分呈先降后升的變化趨勢，最低點均出現在0.10 mmol·L-1的SNP處理下，并且與單獨鹽分處理差異顯著(P<0.05)。

2.5 NO對NaCl脅迫下紅砂Na+和K+選擇性吸收與選擇運輸的影響

如圖4所示，鹽分處理顯著提高了紅砂地上和地下部分中Na+/K+比(P<0.05)，NO與鹽分共同作用下紅砂各部分中Na+/K+比均呈先升后降再升變化趨勢，其中在0.10 mmol·L-1的SNP處理下紅砂地上部分和根部中的Na+/K+比最接近；紅砂地上部分中Na+/K+比在0.10 mmol·L-1的SNP和1.00 mmol·L-1的SNP處理下出現極大值分別為5.53和6.62，最低值出現在0.25 mmol·L-1的SNP處理下為4.97；地下部分中Na+/K+比也在0.10 mmol·L-1SNP和1.00 mmol·L-1SNP處理下出現極大值，分別為5.35和4.43，而最低值出現在0.50 mmol·L-1SNP處理下為3.97。紅砂地下部分限制Na+選擇K+向上運輸的能力(STK+/Na+值)始終小于1，鹽分脅迫下紅砂的STK+/Na+值降低為對照的79.67%，并且差異顯著(P<0.05)；NO和鹽分共同作用后，紅砂的STK+/Na+值呈先升后降的變化趨勢，最高點出現在0.10 mmol·L-1SNP處，為鹽分處理的1.23倍，最低點出現在1.00 mmol·L-1SNP處，為鹽分處理的84.94%。

圖3 NO對NaCl脅迫下紅砂Na+和K+的影響Fig.3 Effects of NO on Na+ and K+content of R.soongorica under salt stress

圖4 NO對NaCl脅迫下紅砂Na+/K+和STK，Na的影響Fig.4 Effects of NO on Na+/K+ and STK+/Na+ of R.soongorica under salt stress

2.6 紅砂Na+、K+、Na+/K+和ST K+/ Na+與紅砂生長的相關性

NO對鹽脅迫下紅砂Na+、K+、Na+/K+和STK+/Na+與紅砂生長指標之間的相關性表現出了一定的一致性(表4)，其中紅砂生長指標(平均株高生長速率和總生物量)與紅砂地下部分中Na+、K+均成極顯著負相關(P<0.01)，與STK+/Na+和地下部分Na+/K+之間均成極顯著正相關(P<0.01)，而與紅砂地上部分中Na+、K+和Na+/K+相關性較弱(P>0.05)。從相關性系數大小的角度看，STK+/Na+值> K+(地下部分)> Na+/K+值(地下部分)> Na+(地下部分)。

表4 NO對鹽脅迫下紅砂Na+、K+、Na+/K+和ST K+/Na+與紅砂生長的相關性系數影響Table 4 Correlation analysis among Na+,K+,Na+/K+ and ST K+/Na+ in R.soongorica under salt stress with supplemental NO

注：*表示顯著相關(P<0.05);**表示極顯著相關(P<0.01)

Note:* indicate significant correlation at the 0.05 level;** indicate highly significant correlation at the 0.01 level

3 討論

一般認為，鹽脅迫通過離子毒害和滲透脅迫所引起的營養不平衡對植物個體造成傷害，引起植物代謝紊亂，影響植物的生長發育[26]。外源NO因可作用于細胞壁組分，使細胞壁松弛，增強膜的流動性，進而增強細胞擴展性，對與鹽脅迫具有很好的調節性而備受關注[7,28]。本研究中，我們通過預實驗發現紅砂植株表現出了很強的耐鹽性，當NaCl濃度達到300 mmol·L-1時才對紅砂株高生長和生物量表現出顯著影響(P<0.05)，這一結果與趙書藝[27]以6周齡紅砂幼苗處理1周后發現300 mmol·L-1的NaCl并未顯著抑制紅砂生長的研究結果不同，可能原因是高鹽濃度且長時間處理下紅砂體內集聚積累了大量的Na+破壞了紅砂的穩態平衡。本研究顯示，外源NO添加確實在一定程度上緩解了鹽脅迫對紅砂植物生物量下降的趨勢，其中以0.10 mmol·L-1的SNP作用最顯著，這與孫立榮[29]對黑麥草生長的研究結果相同。除此之外，NO還可能通過影響紅砂幼苗的滲透調節和抗氧化系統的代謝來增強其對鹽生環境的適應性[7,11-12]。

在鹽脅迫環境下，植物可通過可溶性糖(SS)、脯氨酸(Pro)和可溶性蛋白(SP)等有機物質進行輔助調節。SS除了能為其它有機物的合成提供碳架和能量外[30,31]，還可以通過提高SS的合成進而促進Pro的積累來調節細胞膜的穩定性[32]。而Pro除了參與滲透調節外，可被利用作為SP合成的材料[33]，可發生甲基化使自身含量降低。趙奕翔，鄭春芳等[7,34]分別對小麥和玉竹研究發現NO可以促進植物可溶性糖的合成；劉建新，楊雙龍等[35,36]分別對黑麥草和玉米的研究發現NO通過調節Pro代謝過程不同途徑中的關鍵酶活性來改變植物體Pro的含量提高植物的耐鹽性。本研究中，300 mmol·L-1的NaCl脅迫下紅砂葉片中三種物質含量均下降，低濃度NO作用可促進紅砂葉片中SS的合成，降低Pro和SP含量，高濃度NO作用紅砂葉片中SS含量下降，Pro和SP并未顯著提高，始終低于鹽脅迫處理。三者的相關關系表明Pro與SP和SS之間關系緊密，其中Pro與SP成正相關關系，而與SS成負相關關系，說明NO可以通過改變紅砂葉片中利用SS合成Pro進而合成SP的方向來影響植物的生長，低濃度的NO具有反向調節促進植物生長，而高濃度的NO具有正向調節降低SS抑制生長的作用。

丙二醛(MDA)是具有細胞毒性的物質，能與膜結構上的蛋白質和酶結合、交聯而使之失去活性，從而破壞膜結構，常作為植物遭受質膜過氧化損傷的指標之一[37]。研究發現，NO可以降低鹽脅迫對植物膜系統的損傷[7]。紅砂葉片SS、SP和Pro含量與MDA含量之間的相關關系表明，葉片MDA與SS和Pro含量之間有直接關系，其中SS和MDA成負相關關系，Pro與MDA成正相關關系。說明NO可以通過促進紅砂葉片中SS的合成和Pro的降解來減輕鹽脅迫對植物質膜過氧化的傷害。

植物的耐鹽性在很大程度上取決于植物體內的離子平衡，紅砂是典型的雙子葉鹽生植物。無機離子對雙子葉鹽生植物的滲透調節發揮了主要的作用[26]，其中以Na+和K+占優勢。鹽離子在植物體內的有效分布和積累是植物提高其抗鹽性的重要機制[38]，本研究中，鹽脅迫作用顯著增加了紅砂體內的Na+含量，這有利于提高植物的滲透調節能力[39]。Na+和K+具有相似的離子半徑和水合能,兩者可通過Na-K共轉運蛋白相互競爭吸收位點及活性位點,鹽脅迫下植物根部對Na+吸收增加的同時會抑制對K+的吸收，進而造成植物體內K+的虧缺[40]。在鹽脅迫下對紅砂葉片經NO處理后地上部分離子的動態受到影響，進而影響根部對離子的吸收，使得紅砂地上部分和地下部分中保持了相同的離子和離子選擇變化動態(圖4)。離子的選擇性吸收是植物耐鹽性的重要方式之一[41]，本研究發現，低濃度的NO作用可以縮小鹽脅迫下紅砂地上和地下Na+/K+值，而紅砂Na+/K+值總體成升高趨勢。這與張艷艷[9]對玉米的研究結果相反，主要原因可能是紅砂屬于鹽生植物中的泌鹽植物，鹽生植物主要通過Na+的外排和區域化來減輕Na+在細胞質中累積所造成的毒害作用，而玉米是甜土植物，選擇吸收K+有助于提高其抗鹽能力。說明NO緩解紅砂鹽脅迫可能的機理之一是提高了紅砂的泌鹽性，產生的原因有待后期進一步研究。

紅砂是鹽生植物中的泌鹽植物，在鹽腺泌鹽過程中存在主動的Na+、H+交換，質膜和液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白協同作用，對紅砂鹽腺響應逆境的泌鹽過程發揮著重要作用[28]。本研究中NO對紅砂的耐鹽性有一定的調節作用，但是是否通過Na+、H+交換，質膜和液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白協同作用還有待進一步研究。另一方面，植物的抗鹽能力取決于離子在植物體內的選擇性運輸能力[42]，鹽脅迫減弱了紅砂控制Na+選擇K+向地上部分運輸的能力，一定的NO作用提高了紅砂根部控制Na+選擇K+向地上部分運輸的能力，這可能與NO提高了植物在編碼高親和性鉀離子運輸系統和鉀離子通道基因的表達量有關。紅砂株高生長速率與體內Na+、K+、Na+/K+值和STK+,Na+之間的相關性表明，NO可以通過促進Na+在紅砂根部大量積累，提高地下部分選擇K+向地上部分的輸送能力來適應鹽生環境，而從相關性系數的大小可以看出紅砂地下部分選擇K+向地上部分的輸送能力對紅砂生長的貢獻最大。

4 結論

綜上所述，300 mmol·L-1的NaCl顯著抑制了紅砂植株的生長，改變了紅砂葉片中SS、SP和Pro的含量，誘導了膜脂過氧化，影響了礦質營養元素的吸收和運輸。外源NO能有效的緩解鹽脅迫對紅砂的抑制作用，其中低濃度具有緩解鹽脅迫的作用。說明外源NO可顯著改善紅砂的耐鹽生理特性，其通過選擇性合成有機物質(增加SS的合成量，降低Pro和SP的合成量)，降低膜脂過氧化程度，調控植物體對離子的選擇性吸收和選擇運輸能力(提高植物體對Na+的選擇吸收能力和地下部分選擇K+向地上部分的輸送能力)，從而改善了紅砂的生長性能。