液相色譜串聯質譜法測定水果中多菌靈殘留量

呂小麗，朱春燕，郭平，胡重怡，張威，王棟*

1. 江西省食品檢驗檢測研究院（南昌 330001）；2. 贛州市全標生物科技有限公司（贛州 341100）

多菌靈（Carbendazim）又名棉萎靈、苯井咪唑44號，分子式為C9H9N3O2，為高效低毒內吸性殺菌劑，難溶于水和一般有機溶劑，可溶于硫酸、鹽酸和醋酸等有機酸。多菌靈化學性質穩定，殘留期較長，對大鼠急性口服半數致死量為8.0～10 g/kg，小鼠口服半致死量為5.0 g/kg，對人有一定的毒性，可引起精神恍惚、惡心嘔吐、頭昏頭疼等中毒癥狀。因此，農產品中多菌靈的殘留越來越引起人們的重視。各國對多菌靈的限量要求也越來越嚴格。2011年，歐盟管理委員會發布（EC）No 559/2011號令，將柑桔中多菌靈限量由原來的0.5 mg/kg調整為0.2 mg/kg[1]。2015 年，歐委會根據（EC）No 1107/2009法規，準備逐步淘汰多菌靈[2]。國際食品法典委員會規定多菌靈在黃瓜、橙等作物中的46項限量，限量最低為0.05 mg/kg[3]。美國于07年12月撤銷了多菌靈的限值，而在2009年1月，美國FDA全面禁止進口有多菌靈殘留的農產品[3]。為了更好地應對國外技術壁壘，建立相應的檢測方法是非常必要的。

目前測定多菌靈殘留的方法主要有分光光度法[4]、液相色譜法[5-10]、液相色譜質譜法[11-12]、導數同步熒光法[13]。試驗在弱堿性條件下，采用乙酸乙酯提取試樣中的多菌靈，用MCX固相萃取柱凈化，液相色譜-質譜/質譜法進行檢測，外標法定量。檢測基體包括蘋果、獼猴桃、臍橙、西瓜、葡萄，經方法驗證后，方法的線性范圍、定量限、回收率和精密度均能滿足多菌靈殘留量的檢測要求。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

液相色譜-質譜/質譜儀（Agilent 6495，Agilent公司）；旋渦混合器（IKA MS2，德國）；振蕩器（WSZ-100A，上海一恒科技）；離心機（TDL-5-A，上海安亭）；旋轉濃縮儀（R-215，瑞士BUCHI）；氮吹濃縮儀（NEVP-24，美國Organomation）。

1.2 樣品、試劑和材料

蘋果、獼猴桃、臍橙、西瓜、葡萄，市售。用組織搗碎機將樣品勻漿，混合均勻后裝入潔凈容器內密封并做好標識，即為試樣。所有試樣均在-18 ℃冰箱中保存。

乙酸乙酯、乙腈、甲醇均為色譜純；氫氧化鈉、鹽酸、氨水為分析純；洗脫溶劑為氨水-甲醇（體積比4:96）；配制溶液用水為超純水；多菌靈標準物質（Dr.E公司）純度≥99.0%；混合型強陽離子交換固相萃取柱為Oasis MCX（6 mL，150 mg）。使用前依次用6 mL甲醇、6 mL水和6 mL 0.1 mol/L鹽酸對柱子進行活化；有機系針孔濾膜（0.22 μm，天津津騰）。

1.3 標準溶液的制備

標準儲備液（100 μg/mL）：準確稱取10.0 mg多菌靈標準品，用甲醇溶解并定容至100 mL，混勻。在-18 ℃以下避光保存；標準中間液（10 μg/mL）：在室溫下取1 mL標準儲備液置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容，在4 ℃冰箱內避光保存。

1.4 LC-MS/MS分析條件

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱為C18柱，150 mm（柱長）× 2.1 mm（內徑），粒度5 μm；流動相為乙腈-水（20+80，體積比）；流速為300 μL/min；柱溫為35 ℃；進樣量為5 μL。

1.4.2 質譜/質譜條件

離子化模式為電噴霧電離（ESI）正離子模式；掃描方式為多反應監測（MRM）；分辨率為單位質量分辨率（Unit）；毛細管電壓為3 500 V；干燥氣溫度為350 ℃；干燥氣流量為10 L/min；霧化器壓力為35 psi；碰撞氣為氮氣；其它質譜參數見表1。

表1 主要參考質譜參數

1.5 樣品前處理方法

1.5.1 提取

稱取5 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL離心管中，加入0.5 mL 1.0 mol/L氫氧化鈉溶液和20 mL乙酸乙酯渦旋混勻后，振蕩提取30 min，以4 500 r/min離心5 min，收集上清液到150 mL濃縮瓶中。殘渣再加入20 mL乙酸乙酯，重復提取1次，合并上清液，在45 ℃下旋轉蒸發濃縮至5 mL左右，轉移至25 mL離心管中，在45℃下氮氣吹干，加入10 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液，超聲5 min溶解，待凈化。

1.5.2 凈化

將上述待凈化溶液全部轉移至活化好的MCX柱中，再依次用6 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液、6 mL甲醇淋洗小柱，棄去淋洗液；真空抽干2 min，用6 mL氨水-甲醇溶液（4+96，V:V）進行洗脫，收集洗脫液。在45 ℃下氮吹干，準確加入5.0 mL乙腈-水溶液（20+80，V:V），超聲2 min溶解殘渣，混勻后，取部分溶解液過0.22 μm微孔濾膜后，供液相色譜-質譜/質譜儀測定。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

目前常用于提取多菌靈的溶劑有乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯，因此試驗過程中分別選取乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯作為提取溶劑，取10份陰性的臍橙樣品，添加濃度為20 μg/kg，對樣品中的多菌靈進行提取，回收率如表2所示。甲醇、乙酸乙酯和堿性乙酸乙酯的提取效果都不錯，但考慮到甲醇的沸點較高，在后續濃縮過程會延長時間，可能會造成待測物損失。另由于多菌靈在酸性條件下極性較強，易溶于水及一些極性溶劑，只有在中性及弱堿性條件下極性弱，更易溶于一些非極性的有機溶劑。通過試驗也發現乙酸乙酯溶液中加入氫氧化鈉溶液后回收率更高，因此最終選擇乙酸乙酯在弱堿性條件下提取。

表2 不同提取溶劑的多菌靈回收率結果

2.2 提取方式的選擇

目前振蕩提取和勻漿提取是實驗室中水果樣品最常用的提取方法。取兩個含有多菌靈的臍橙樣品，分別采用勻漿提取和振蕩提取進行3次平行試驗，并對結果進行比較，結果如表3所示。結果表明，振蕩提取效果更好，而且操作簡便，適合于大批量檢測，因此最終提取方式選用振蕩提取。

表3 不同提取方式下多菌靈檢出量 mg/kg

2.3 提取次數的選擇

為保證樣品中多菌靈能夠提取完全，對提取次數進行研究。試驗采用20.0 μg/kg的添加水平，改變提取次數，多菌靈的回收率如圖1所示。結果表明，振蕩提取2次，多菌靈已基本提取完全。增加提取次數會導致后續操作時間延長，不利于后續的濃縮步驟，因此從試驗效果、提取時間和試驗成本等因素考慮，確定提取次數為提取2次。

圖1 多菌靈回收率與提取次數變化趨勢圖

2.4 凈化方式的選擇

目前常用于多菌靈凈化的固相萃取柱有C18固相萃取柱和MCX混合型陽離子交換柱。試驗采用100.0 μg/kg的添加水平，對蘋果和臍橙樣品分別考察C18柱和MCX柱的凈化效果，多菌靈回收率結果如表4所示。從表4可以看出，MCX柱凈化后多菌靈的回收率結果比C18柱凈化后回收率更高，因此選用MCX混合型陽離子交換柱作為凈化小柱。

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表4 C18固相萃取柱和MCX固相萃取柱凈化后回收率比較 %

2.5 液相色譜條件選擇

對多菌靈標準溶液進行分析時發現以甲醇-水為流動相時，多菌靈峰型寬且拖尾，改用乙腈-水為流動相后，峰寬變小，峰形變尖銳。因此試驗采用乙腈-水為流動相。不同流動相下多菌靈標準圖譜如圖2和圖3所示。

圖2 不同流動相下多菌靈標準圖譜（流動相：甲醇-水）

圖3 不同流動相下多菌靈標準圖譜（流動相：乙腈-水）

2.6 質譜條件的選擇

以多菌靈標準溶液為對象，用全掃描方式進行掃描，選取m/z 192.2為母離子，通過二級質譜碎裂，獲取了三個信號最強的子離子，分別為m/z 160.1，132.0和105.0。

2.7 質譜基質效應

分別采用試劑標準曲線和基質標準曲線對同時處理的多個添加回收試驗進行回收率校準，各回收率如表5所示。從兩種標準曲線校準所得回收率可以看出兩者無很大區別，說明基質影響小，而且由于多菌靈為限用藥物，很難獲得完全陰性的樣品作為基質，因此方法采用試劑線性進行校準。

表5 試劑標準曲線和基質標準曲線校準后回收率數據（n=6）

2.8 方法學驗證

2.8.1 線性范圍和定量限

在方法所確定的試驗條件下，多菌靈在5.0～200 ng/mL范圍內呈良好的線性關系，線性相關系數為0.999 9，線性回歸曲線如圖4所示。當添加水平為0.01 mg/kg時，信噪比（S/N）大于10，可滿足定量檢測要求；方法的定量限可達0.01 mg/kg，能夠滿足我國對水果中多菌靈監控的需求。

圖4 線性回歸曲線

方法采用向陰性樣品中添加的方式進行方法學評估。以不含多菌靈的蘋果、獼猴桃、臍橙、西瓜、葡萄為基質，進行10.0，20.0和40.0 μg/kg三個不同濃度水平的添加回收試驗，每個水平進行6次平行測定，回收率范圍在88.2%～100.5%之間，相對標準偏差在2.05%～8.78%之間，具體結果如表6所示，表明方法能夠滿足農獸藥殘留檢測的需求。

表6 不同基質加標樣品的回收率和精密度試驗結果（n=6）

3 結論

研究結果表明，樣品在弱堿性條件下采用乙酸乙酯振蕩提取后，用MCX固相萃取柱凈化，液相色譜-質譜/質譜法測定蘋果、獼猴桃、臍橙、西瓜、葡萄等水果中多菌靈，經方法驗證后，方法的線性范圍、定量限、回收率和精密度均能滿足多菌靈殘留量的檢測要求。方法靈敏度高、回收率高，可用于水果中多菌靈的確證檢測。