高通量抗生素殘留初篩試劑盒的研制及應(yīng)用

范 維，高曉月，李賀楠，郭文萍，陳淑敏，孫 勇，李瑩瑩*

（中國肉類食品綜合研究中心，北京食品科學(xué)研究院，北京 100068）

抗生素作為一種殺菌或抑菌藥物，在養(yǎng)殖、臨床、農(nóng)業(yè)等方面得到廣泛應(yīng)用，但濫用會導(dǎo)致其殘留于動物體內(nèi)，通過食物鏈進入人體，影響人類疾病治療與康復(fù)，甚至引起嚴重的食品安全和出口貿(mào)易問題[1-4]。當前，我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)主要使用的抗生素包括四環(huán)素類、氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類及大環(huán)內(nèi)酯類等[5-6]，為了增強抗生素療效，縮短療程，減少細菌耐藥性，現(xiàn)經(jīng)常把不同類抗生素進行配伍使用，這無形中加大了抗生素殘留檢測難度，預(yù)示著高通量的檢測方法將成為未來檢測發(fā)展趨勢。目前，抗生素殘留檢測方法主要有色譜法[7-8]、微生物法[9]和免疫分析法[10]等，其中色譜法較為常用，可以進行定性定量檢測，結(jié)果靈敏準確，但設(shè)備投入大，不同類別抗生素前處理和檢測條件不同，很難做到聯(lián)合檢測[11-12]；免疫分析法雖靈敏度高，但是檢測成本昂貴，只能檢測單一類抗生素[13]，不易于高通量；相較于前兩種方法，微生物法是抗生素殘留檢測最早采用的方法，其成本低廉、操作簡單、具有廣譜性，可作為一種高通量抗生素初篩方法在中小型食品企業(yè)得到普及。

目前已有的微生物法多用于牛奶中抗生素殘留檢測，在禽畜肉中應(yīng)用較少，這主要是由于禽畜肉基質(zhì)較為復(fù)雜，抗生素提取存在難度[14]。而對于微生物顯色法試劑盒的開發(fā)，由于微生物本身活性受外界因素影響較大，且這種活性需要活化傳代維持，因此如何能在保障其活性的前提下，將其進行保存和運輸，并且不影響顯色反應(yīng)，是目前制約其研制的技術(shù)難點。本實驗結(jié)合前期的研究成果[15]，在確定了適用于禽畜肉中抗生素提取方法以及檢測液配方的基礎(chǔ)上，進一步克服了因菌種活化傳代耗時較長及液體菌種無法運輸?shù)葐栴}，開發(fā)出一種可檢測動物源性食品中抗生素殘留的高通量微生物顯色初篩試劑盒，并對試劑盒的各方面性能加以驗證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品與菌種

禽畜肉購自超市或農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場。嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus sterothermophilus CICC 10392） 食品安全菌種保藏中心。

1.1.2 試劑

β-內(nèi)酰胺類：阿莫西林、氨芐西林、青霉素G、青霉素V、氯唑西林、乙氧萘青霉素、雙氯青霉素、水合氨芐青霉素；四環(huán)素類：四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素；氨基糖苷類：慶大霉素、鏈霉素、新霉素、安普霉素、丁胺卡那霉素；大環(huán)內(nèi)酯類：紅霉素、羅紅霉素、泰樂霉素標準品 德國Dr. Ehrenstorfer公司；營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基、腦心浸液肉湯（BHI）培養(yǎng)基、溴鉀酚紫葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基、蛋白胨、牛肉浸膏、葡萄糖、溴甲酚紫 北京陸橋技術(shù)有限責任公司；海藻酸鈉、明膠、卡拉膠、聚乙烯醇、二醋酸纖維素、硼酸、氯化鈣、磷酸氫二鈉均為分析純。

抗生素標準儲備液：將氨基糖苷類和β-內(nèi)酰胺類各抗生素標準品分別用去離子水溶解并定容至100 μg/mL，-20 ℃避光可保存1 個月；將大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類各抗生素標品分別用甲醇溶解并定容至100 μg/mL，-18 ℃避光可保存12 個月以上。

檢測液：蛋白胨10.0 g、牛肉浸膏3.0 g、葡萄糖10.0 g、NaCl 5.0 g、溴甲酚紫指示劑0.04 g、蒸餾水定容至1 000 mL，pH值調(diào)至7.0，121 ℃高壓滅菌10 min[15]。

1.2 儀器與設(shè)備

FC酶標儀 芬蘭雷勃儀器有限公司；DHP-9272恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UltiMate3000-TSQ QUANTUM ULTRA液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源） 美國Thermo公司；1200-6410液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源）、1260高效液相色譜（配有可變波長紫外檢測器） 美國安捷倫公司；TD4離心機 鑫港儀器有限公司；PHS-3C pH計 上海雷磁儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液制備

在無菌狀態(tài)下，從NA培養(yǎng)基上挑取已活化好的株菌，接入BHI培養(yǎng)基中，充分振蕩，以3 000 r/min離心5 min，棄去上清液，向離心管中重新加入BHI培養(yǎng)基，如此反復(fù)離心洗滌3 次后，用BHI培養(yǎng)基充分溶解沉淀，根據(jù)波長為600 nm處的吸光度，制備一定濃度的菌懸液。

1.3.2 菌種微膠囊包埋方法確定

1.3.2.1 菌種包埋方法選擇

分別采用海藻酸鈉法[16]、明膠法[16]、卡拉膠法[16]、二醋酸纖維素法[17]及聚乙烯醇法[17]對一定濃度的指示菌進行包埋，通過對包埋小球進行包埋操作難易程度分析、機械強度及菌種成活率測試，選取適合微生物顯色法的包埋方法。

1.3.2.2 菌種包埋條件優(yōu)化

配制10 mL溴鉀酚紫葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基，向其中加入一定量的聚乙烯醇，使其質(zhì)量濃度分別為0.08、0.1、1.2 g/mL攪拌混勻，于121 ℃滅菌10 min。待冷卻至40 ℃后，向上述溶液中分別加入10 mL初始吸光度（A600nm）為0.5、0.8、1.0、1.2的指示菌懸液，混合均勻，用6號針頭緩慢滴入pH值分別為5.2、6.0、6.8、7.5的硼酸-磷酸鹽溶液中，于4 ℃靜置1 h，抽濾出包埋顆粒，用生理鹽水洗凈，密封4 ℃保存、備用。通過對包埋小球進行機械強度、菌種成活率、抗生素敏感性及反應(yīng)時間測試，確定最佳包埋條件。

1.3.2.3 機械強度測試

兩塊載玻片之間放置粒徑相近的包埋小球，在上面的載玻片上加100 g砝碼，觀察小球外形有無變化，用裂痕和壓碎程度表征小球的機械強度。

1.3.2.4 菌種成活率測試

將4 ℃保存1 周的包埋菌株放到150 μL檢測液中，每菌株設(shè)置25 個平行，于62 ℃恒溫培養(yǎng)，4 h內(nèi)使檢測液變黃的即為成活，對比觀察不同包埋條件菌種的成活情況，計算成活率。

1.3.2.5 抗生素敏感性實驗

向96 微孔板中依次分別加入150 μL檢測液，50 μL菌懸液（或一顆包埋菌株顆粒）和100 μL 0.1 μg/mL的抗生素標準溶液，于62 ℃培養(yǎng)，觀察檢測液變色情況及反應(yīng)時間。

1.3.3 樣品前處理

1.3.3.1 具體操作[15]

稱取均質(zhì)好的10 g肌肉（瘦肉）樣品置于50 mL離心管中，加入10 mL pH 7.4的磷酸鈉緩沖溶液，旋渦1 min，密封置100 ℃沸水浴中加熱5 min，10 000 r/min離心3 min，上清液即為樣品提取液。

1.3.3.2 方法驗證

以四環(huán)素為例，分別向豬、牛、羊、雞、鴨的肌肉（瘦肉）樣品中注射不同濃度的四環(huán)素標準溶液，每組進行3 個平行，按1.3.3.1節(jié)的操作進行樣品前處理，之后將樣品提取液進行色譜測定，確定該前處理方法的提取效率，并將各樣品提取液進行微生物顯色法驗證，確定檢測效果。

1.3.4 試劑盒操作及結(jié)果判定

根據(jù)樣品數(shù)量取出已固定有指示菌包埋顆粒的微孔，依次向每孔中加入檢測液150 μL，陽性對照、陰性對照、空白對照及樣品提取液各200 μL，對照組和樣品組各取3 個平行。于62 ℃恒溫培養(yǎng)至陰性對照變成黃色，觀察其他孔顏色變化。其中陽性對照為抗生素標準溶液；陰性對照為無抗生素殘留的肌肉（瘦肉）提取液；空白對照為0.85%生理鹽水。結(jié)果判定：樣品孔檢測液呈黃色為陰性（-），紫色為陽性（+）。

1.3.5 試劑盒檢出限確定

1.3.5.1 單標抗生素檢出限

用去離子水將20 種抗生素標準儲備液進行梯度稀釋，用試劑盒進行檢測，確定各單標抗生素的檢出限。

1.3.5.2 配伍抗生素檢出限

對常配伍使用的四環(huán)素類和氨基糖苷類抗生素、β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類抗生素進行混合，配伍方案及系列梯度中各抗生素終質(zhì)量濃度見表1。用試劑盒對混合抗生素梯度進行檢測，確定混合抗生素的檢出限。

表1 抗生素配伍方案及系列梯度Table 1 Antibiotic combinations with concentration gradients

1.3.6 試劑盒穩(wěn)定性

試劑盒密封好后于4 ℃保存1、3、5、10、15、18、20 d，用單標抗生素稀釋梯度進行檢出限和反應(yīng)時間驗證，確定試劑盒最佳使用期限。

1.3.7 試劑盒的評價

從不同市場分別購進豬肉20 份、牛肉15 份、羊肉15 份、雞肉10 份、鴨肉10 份，共計70 份，分別用序號1～70標識，為保證有一定的陽性檢出率，對一部分購買樣品進行人工添加。

用本實驗研制的試劑盒對樣品進行檢測，之后用色譜法進行驗證。大環(huán)內(nèi)酯類：參照SN/T 1777.2—2007《動物源性食品中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留測定方法》[18]進行檢測；四環(huán)素類和氨基糖苷類：分別參照GB/T 21317—2007《動物源性食品中四環(huán)素類獸藥殘留量檢測方法》[19]和GB/T 21323—2007《動物組織中氨基糖苷類藥物殘留量的測定》[20]方法進行檢測；β-內(nèi)酰胺類：參照SN/T 2050—2008《進出口動物源食品中14 種β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留量檢測方法》[21]和GB 29682—2013《水產(chǎn)品中青霉素類藥物多殘留的測定》[22]方法進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株包埋方法的確定

從表2可知，雖然明膠和卡拉膠的菌株成活率較高，但兩者機械強度較低，顆粒易破碎使得被包埋細胞泄出，并且明膠在切塊時易黏連，不易操作，且通過后期顯色實驗發(fā)現(xiàn)，這兩種載體存在顯色不均的情況，因此這兩種材料不適合作顯色反應(yīng)的載體。采用醋酸纖維素作包埋載體，雖然顆粒機械強度高，但成活率極低，其原因可能是醋酸纖維素中添加的丙酮對菌株細胞傷害較大[23]，故也不適合作包埋載體。采用海藻酸鈉作載體，成球容易，菌株成活率高，但通過后期進一步實驗發(fā)現(xiàn)，海藻酸鈉化學(xué)穩(wěn)定性差，與肉提取液（磷酸鹽緩沖液）混合極不穩(wěn)定，易吸脹破裂，影響顯色反應(yīng)。因此，選擇聚乙烯醇作為包埋載體，其菌株成活率達到80%，機械強度高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，抗微生物分解性能強，且易操作[17]。

表2 不同包埋方法的難易程度及表觀特征Table 2 Difficulty and apparent characteristics of different embedding methods

2.2 菌株包埋條件優(yōu)化結(jié)果

對現(xiàn)有的聚乙烯醇-硼酸包埋法進行改進，改用硼酸-磷酸鹽溶液作為交聯(lián)劑，并對相關(guān)條件進行優(yōu)化。從表3可知，當聚乙烯醇質(zhì)量濃度為0.1 g/mL時，成球效果最佳。

表3 聚乙烯醇質(zhì)量濃度對包埋效果的影響Table 3 Effect of polyvinyl alcohol concentration on embedding efficiency

表4 交聯(lián)劑pH值對包埋及檢測效果的影響Table 4 Effect of pH value of cross-linking agent on the efficiency of embedding and detection

交聯(lián)劑pH值對包埋及檢測效果影響情況見表4。將交聯(lián)劑改為硼酸-磷酸鹽是因為硼酸自身毒性以及提供的酸性環(huán)境會降低菌種活性，加入磷酸鹽，一方面可以縮短在硼酸中的交聯(lián)時間減少毒性，另一方面可以改善pH值，為菌種提供適宜生存條件，提高菌種存活率[24]。從表4可知，當pH值較低時，成球形狀不規(guī)則，小球自身低pH值會使檢測液中的指示劑變色，影響顯色反應(yīng)，且過酸會降低指示菌成活率；而當交聯(lián)劑pH值較高時，小球加入到檢測液后會升高其pH值，從而延長反應(yīng)時間。因此，選擇pH 6.0的硼酸-磷酸鹽溶液作為交聯(lián)劑。

表5 菌種初始A600 nm對檢測效果的影響Table 5 Effect of initial bacterial suspension concentration on detection efficiency

從表5可知，當菌種初始A600nm為0.5時，抗生素對菌株的抑制效果較好，但由于菌株濃度較低，導(dǎo)致反應(yīng)時間較長且存活率較低；當菌懸液初始吸光度較高時，抗生素對菌的抑制效果不明顯，反應(yīng)終點時檢測液變?yōu)辄S色，達不到檢測目的。因此，選擇初始A600nm為0.8的指示菌進行包埋。

2.3 樣品提取效果驗證

從表6可知，該提取方法對不同肌肉（瘦肉）樣品中抗生素殘留提取率為79.8%～88.1%，相對標準偏差為3.5%～5.2%。進一步對各提取液的檢測效果進行驗證發(fā)現(xiàn)，經(jīng)加熱沉淀蛋白后，鴨、雞、豬肉樣品的提取液呈現(xiàn)無色，離心后較為澄清，而牛、羊肉樣品的上清液呈微紅色，但只要其中抗生素殘留超過微生物法檢出限，不會對檢測結(jié)果造成影響。

表6 不同樣品提取效率及顯色效果Table 6 Efficiency of extraction and color development of different samples

2.4 試劑盒檢出限測定結(jié)果

按1.3.5節(jié)方法進行檢測，檢出限效果見圖1，以顏色未發(fā)生變化的標準液質(zhì)量濃度為該抗生素的最小檢測質(zhì)量濃度。

圖1 檢出限效果圖Fig. 1 No color change occurred at the detection limit

表7 單標抗生素檢出限量Table 7 Detection limits for single antibiotics

從表7可知，本試劑盒各類抗生素的檢出限均小于我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定的動物性食品中獸藥最高殘留限量[25]，其中對β-內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類抗生素較為敏感，檢出限分別為20～40、40～60 μg/kg，這與謝莉等[26]研究的用嗜熱脂肪芽孢桿菌檢測牛奶中抗生素殘留結(jié)果相似。相較于色譜法，該試劑盒檢出限更接近最大殘留限量，因此本試劑盒初篩呈陽性的樣品更有可能是不合格樣品，之后將這些陽性樣品用色譜法進行復(fù)測，可以節(jié)約時間和成本。并且有時企業(yè)并不需要太精準的數(shù)值，只需檢測購入的原料肉中抗生素殘留是否合格，對靈敏度無過高要求，以免成本提高造成浪費。

表8 配伍抗生素檢出限Table 8 Detection limits for antibiotic combinations

從表8可知，該試劑盒對常配伍使用的抗生素也能進行檢測，且檢出限均較單標低，說明四環(huán)素類和氨基糖苷類抗生素、β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類抗生素聯(lián)合使用對指示菌抑制效果增強，具有協(xié)同作用，這與李娟[27]對氨基糖苷類抗生素配伍禁忌研究結(jié)果一致。

2.5 試劑盒穩(wěn)定性測定結(jié)果

將試劑盒于4 ℃保存，每間隔一定時間用慶大霉素、四環(huán)素進行反應(yīng)時間和檢出限驗證，結(jié)果見表9。隨著保存時間延長，反應(yīng)時間和檢出限均受到影響，這是由于菌體自身處于一個衰減的過程，隨保存時間延長菌體數(shù)量和活性都會隨之降低造成的，而15 d內(nèi)試劑盒的反應(yīng)時間和檢出限均可保持穩(wěn)定狀態(tài)，因此，該試劑盒的最佳使用期限為15 d。

表9 試劑盒穩(wěn)定性Table 9 Stability of the kit

2.6 試劑盒評價結(jié)果

表10 微生物法與色譜法樣品檢測結(jié)果Table 10 Results obtained on samples using the kit and chromatography

將70 個樣品進行試劑盒檢驗，之后用色譜法進行驗證，結(jié)果見表10。試劑盒檢測共有24 個樣品呈陽性，經(jīng)色譜法驗證，其中18 個陽性樣品含有以上添加的抗生素殘留，其余6 個為假陽性樣品，據(jù)研究[28-29]嗜熱脂肪芽孢桿菌除對抗生素敏感外，對磺胺類、糖肽類等藥物也有較高的敏感性，因此6 個假陽性樣品存在含有其他抗生素的可能。而試劑盒檢測呈陰性的46 個樣品，經(jīng)色譜法驗證，沒有測出本實驗規(guī)定的藥物殘留，說明該試劑盒結(jié)果可靠，雖存在一定的假陽性結(jié)果，但只要抗生素殘留量超過其方法檢出限，無假陰性結(jié)果存在。

3 結(jié) 論

本研究以樣品中抗生素殘留影響菌種生長產(chǎn)酸，從而使檢測液中指示劑顏色發(fā)生變化為原理，選用具有廣譜敏感性的嗜熱脂肪芽孢桿菌作為指示菌，并將其微膠囊包埋固定于96 微孔板中，克服了因菌種活化傳代耗時較長及液體菌種無法運輸?shù)葐栴}，研制了檢測動物源性食品中抗生素殘留的高通量初篩試劑盒。為了提高試劑盒的靈敏度和穩(wěn)定性，本實驗分析對比不同包埋方法，并對菌種包埋濃度、包埋劑添加量及交聯(lián)劑pH值進行了優(yōu)化。該試劑盒對禽畜肉中常見的β-內(nèi)酰氨類、四環(huán)素、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素藥物無論是單獨使用還是配伍使用都具有較好的檢測靈敏度，在15 d的保存期內(nèi)，具有較好的檢測穩(wěn)定性。該試劑盒操作簡便、快捷，包括前處理在內(nèi)4～5 h即可完成檢測，結(jié)果肉眼可辨別，無需借助大型儀器。采用可獨立拆分的微孔板，可根據(jù)樣品數(shù)隨意調(diào)節(jié)，做到用同一前處理方法、同一檢測體系對不同樣品、不同抗生素的高通量檢測。用色譜法對試劑盒篩檢出的46 個陰性樣品進行驗證，均無抗生素藥物殘留，說明該試劑盒結(jié)果可靠，無假陰性存在。因此可以采用該試劑盒進行篩檢，再以色譜法對呈陽性的樣品進行復(fù)測，以便減少成本和提高效率，這將在食品企業(yè)及一般檢測實驗室具有良好的推廣前景。