超濾法結(jié)合UPLC-MS/MS法研究樹豆酮酸A在不同種屬血漿中的血漿蛋白結(jié)合率Δ

班玉娟，張麗，陳瑞，朱高峰，，王建塔，，陳文章，湯磊，，黃靜#（.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽(yáng)550004；.貴州省化學(xué)合成藥物研發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，貴陽(yáng) 550004）

樹豆酮酸A（Cajanonic acidA）是從樹豆葉中分離出來的一種新的菧類化合物。已有體內(nèi)和體外研究表明，樹豆酮酸A具有降血糖活性[1]，可促進(jìn)人肝癌細(xì)胞HepG2對(duì)葡萄糖的消耗[2]，可通過調(diào)節(jié)蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B（Protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B）和相關(guān)胰島素信號(hào)因子的表達(dá)來恢復(fù)胰島素信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，能有效降低2型糖尿病大鼠的空腹血糖、血清總膽固醇、三酰甘油及低密度脂蛋白膽固醇水平，能保護(hù)器官免受損傷[3]；此外，樹豆酮酸A還可以抑制脂肪細(xì)胞分化并降低各種脂肪形成相關(guān)mRNA的基因水平[4]。由此可見，樹豆酮酸A是一個(gè)潛在的可開發(fā)用于治療2型糖尿病或肥胖癥的藥物。

藥物血漿蛋白結(jié)合率是指藥物吸收后與血漿中所有蛋白結(jié)合的量占藥物總量的百分比，是藥動(dòng)學(xué)的重要參數(shù)之一，藥物與血漿蛋白的結(jié)合作用影響藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝與排泄，從而影響其藥理效應(yīng)[5]。藥物被吸收后，只有沒有與血漿蛋白結(jié)合的游離藥物才能通過生物膜并作用于靶器官發(fā)揮藥理作用，因此測(cè)定藥物與血漿蛋白的結(jié)合率在新藥研發(fā)及臨床研究中非常重要[6]。研究藥物血漿蛋白結(jié)合率的方法有微透析法、平衡透析法、超濾法、超速離心法等[7]，本研究采用超濾法聯(lián)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法分別測(cè)定低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（2.5、5、20 μg/mL）的樹豆酮酸A在大鼠、家兔及健康人血漿中的蛋白結(jié)合率，以期為樹豆酮酸A的后期藥效學(xué)、藥理學(xué)和臨床研究提供依據(jù)。樹豆酮酸A的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 樹豆酮酸A的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig1 Chemical structure of cajanonic acidA

1 材料

1.1 儀器

Xevo G2-XS型UPLC-四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，配有MassLynx V4.1質(zhì)譜工作站、UNIFI 7.0數(shù)據(jù)庫(kù)（美國(guó)Waters公司）；Amicon Ultra-0.5型超濾離心管（美國(guó)Millipore公司，截留相對(duì)分子量：10 000）；pHS-3C型酸度計(jì)（上海雷磁儀器廠）；ThermoShaker R制冷型恒溫混勻儀（北京昊諾斯科技有限公司）；JN300-2型氮?dú)獯祾邇x（蘇州吉米諾儀器有限公司）；X1型高速離心機(jī)（香港基因有限公司）；FA805N型十萬(wàn)分之一電子天平（上海菁海儀器有限公司）；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋[邦西儀器科技（上海）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

樹豆酮酸A對(duì)照品[由貴州醫(yī)科大學(xué)藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備，批號(hào)：20181226，經(jīng)高效液相色譜（HPLC）和核磁結(jié)構(gòu)鑒定，純度：＞98%]；健康人血漿（由貴州省血液中心提供，批號(hào)：20180608，許可證號(hào)：07001）；磷酸鹽緩沖液（PBS）干粉（北京索萊寶科技有限公司）；甲醇、乙腈、乙酸乙酯和甲酸均為色譜純，水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水，其他試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，♀♂各半，體質(zhì)量200～230 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（湘）2014-0011；SPF級(jí)新西蘭白兔，♀♂各半，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（湘）2014-0010。所有動(dòng)物均購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 血漿的采集

2.1.1 大鼠血漿 取SD大鼠，♀♂各半，股動(dòng)脈取血，置于裝有肝素鈉溶液的EP管中，立刻于4℃、3 500 r/min離心10 min，分離上層血漿，－20℃冷凍貯存。

2.1.2 家兔血漿 取家兔，♀♂各半，心臟取血，置于裝有肝素鈉溶液的EP管中，立刻于4℃、3 500 r/min離心10 min，分離上層血漿，－20℃冷凍貯存。

2.2 溶液的制備

2.2.1 PBS 精密稱取PBS干粉2.24 g，置于200 mL量瓶中，用超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.01 mol/L、pH 7.4的PBS，于4℃貯存，備用。

2.2.2 樹豆酮酸A貯備液 精密稱取樹豆酮酸A對(duì)照品25.00 mg，置于25 mL量瓶中，加少量甲醇，超聲（功率：600 W，頻率：40 kHz）10 min使其溶解，再以pH 7.4的PBS定容，搖勻，即得1 mg/mL的樹豆酮酸A貯備液。

2.3 樣品預(yù)處理

取“2.6”項(xiàng)下超濾液與孵育液各100 μL分別置于EP管中，加入600 μL甲醇，渦旋混勻5 min后，以12 000 r/min離心10 min（均在4℃下進(jìn)行）。取上清液于37℃下氮?dú)獯蹈?，加?00 μL蒸餾水與600 μL乙酸乙酯復(fù)溶，渦旋混勻5 min后，萃取，靜置分層后取上層液于37℃下氮?dú)獯蹈桑僖?00 μL甲醇復(fù)溶，12 000 r/min離心10 min，取上清液適量進(jìn)樣分析。

2.4 色譜條件與質(zhì)譜條件

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；保護(hù)柱為 WatersVanGuard BEH C18（2.1 mm×5 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為0.01%甲酸溶液（溶劑A）和含0.01%甲酸的乙腈溶液（溶劑B），梯度洗脫（0～0.5 min，30%B；0.5～2 min，30%→98%B；2～3 min，98%B；3～5 min，98%→30%B；流速為0.15 mL/min）；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為2 μL。

2.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源（ESI）；負(fù)離子模式采集（Negative）；毛細(xì)管電壓為1.5 kV；錐孔電壓為30 V；離子源溫度為100℃；脫溶劑氣溫度為400℃；錐孔氣流量為50 L/h；脫溶劑氣流量為800 L/h；掃描范圍為質(zhì)荷比（m/z）50→1 200；數(shù)據(jù)采集分析軟件為Masslynx V 4.1；數(shù)據(jù)采集模式為全掃描。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性 分別取大鼠、家兔及人血漿，按照“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，制成3個(gè)種屬的空白血漿樣品；取樹豆酮酸A貯備液分別以大鼠、家兔及人血漿稀釋后，按照“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，制成3個(gè)種屬的樹豆酮酸A血漿樣品；取樹豆酮酸A對(duì)照品以甲醇溶解，制成樹豆酮酸A對(duì)照品溶液；取大鼠、家兔及人血漿孵育液及超濾液各100 μL，按照“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，制成不同種屬的孵育液及超濾液樣品。處理后的樣品及對(duì)照品按照“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)行UPLC-MS/MS測(cè)定，考察該方法專屬性。

2.5.2 線性關(guān)系、定量下限與檢測(cè)限 精密量取一定量的1 mg/mL樹豆酮酸A貯備液，用PBS逐一稀釋制成0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、26 μg/mL系列質(zhì)量濃度的溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度取50 μL，平行3份，分別加入大鼠、家兔及人血漿950 μL，渦旋混勻1 min，置于37℃水浴中60 min后，各取100 μL按照“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，再按照“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)行UPLC-MS/MS測(cè)定，記錄峰面積。以樹豆酮酸A的峰面積為縱坐標(biāo)（y）、樹豆酮酸A質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/mL）進(jìn)行線性回歸。以線性范圍下限為定量下限，以信噪比3∶1對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢測(cè)限。

2.5.3 精密度與回收率 參考文獻(xiàn)[8]中方法，精密量取一定量的1 mg/mL樹豆酮酸A貯備液，以PBS稀釋后，各取50 μL，分別加入大鼠、家兔及人血漿950 μL，制成質(zhì)量濃度分別為2.5、5、20 μg/mL的樹豆酮酸A質(zhì)控（QC）血漿樣品，取100 μL按照“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，再按照“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)行UPLC-MS/MS測(cè)定，記錄峰面積，平行5份，每日測(cè)5次，考察日內(nèi)精密度，并將峰面積代入回歸方程計(jì)算樹豆酮酸A濃度，以測(cè)得濃度/理論濃度×100%計(jì)算回收率；連續(xù)進(jìn)樣5 d，考察日間精密度。

2.5.4 基質(zhì)效應(yīng) 按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備低、中、高質(zhì)量濃度（2.5、5、20 μg/mL）3個(gè)種屬的樹豆酮酸A QC血漿樣品（平行6份），按照“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，再按照“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)行UPLC-MS/MS測(cè)定，測(cè)得峰面積（A1）。另以甲醇配制相同低、中、高質(zhì)量濃度的樹豆酮酸A的QC樣品（不含基質(zhì)，平行6份），按照“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)行UPLC-MS/MS測(cè)定，測(cè)得峰面積（A2），以A1/A2計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。

2.5.5 穩(wěn)定性 按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備低、中、高質(zhì)量濃度（2.5、5、20 μg/mL）3個(gè)種屬的樹豆酮酸A QC血漿樣品，將樣品分別放置于冰箱冷藏（4℃）、室溫（約20℃）、孵育溫度（37℃）條件下12 h和反復(fù)凍融（4℃冷凍，37 ℃融化）3次后，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理，再按照“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行UPLC-MS/MS測(cè)定，平行5份，考察其穩(wěn)定性。

2.6 血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定

參考文獻(xiàn)[9]中方法，精密量取一定量的1 mg/mL樹豆酮酸A貯備液，以PBS分別稀釋制成50、100、400 μg/mL 3個(gè)質(zhì)量濃度的樹豆酮酸A溶液，備用。取相應(yīng)樹豆酮酸A溶液50 μL（每個(gè)質(zhì)量濃度平行3份），分別加入950 μL大鼠、家兔及人血漿，渦旋混勻，制成2.5、5、20 μg/mL的樹豆酮酸A血漿樣品。將其置于37℃恒溫水浴中孵育60 min，得孵育液。將孵育液取出置于冰上（保持低溫4℃左右），移500 μL至超濾管中，于低溫冷凍離心機(jī)中，在4℃、12 000 r/min下離心20 min，得超濾液。取孵育液及超濾液各100 μL按照“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，分別取上清液按照“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)行UPLCMS/MS測(cè)定，代入回歸方程算得孵育液和超濾液中樹豆酮酸A的質(zhì)量濃度，根據(jù)公式（1）計(jì)算血漿蛋白結(jié)合率：

式中，c孵育液表示超濾前孵育液中樹豆酮酸A的質(zhì)量濃度（μg/mL）；c超濾液表示超濾液中樹豆酮酸A的質(zhì)量濃度（μg/mL）。將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分別對(duì)同種種屬中不同質(zhì)量濃度之間樹豆酮酸A的血漿蛋白結(jié)合率進(jìn)行單因素方差分析，不同種屬之間樹豆酮酸A的血漿蛋白結(jié)合率進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察結(jié)果

3.1.1 專屬性 大鼠、家兔和人3個(gè)種屬間的空白血漿樣品、樹豆酮酸A血漿樣品及其孵育液、超濾液樣品經(jīng)處理后進(jìn)樣得到的色譜圖基本一致，因此以人血漿為基質(zhì)制備的樣品所得色譜圖作為代表圖，省略以大鼠血漿與家兔血漿為基質(zhì)制備的樣品色譜圖?？瞻兹搜獫{樣品、樹豆酮酸A對(duì)照品、加入樹豆酮酸A的人血漿樣品、樹豆酮酸A人血漿孵育液及超濾液樣品的色譜圖見圖2。

圖2 總離子流圖Fig 2 TIC chromatogram

由圖2所示，該檢測(cè)方法下，樹豆酮酸A的保留時(shí)間為1.25 min，在進(jìn)樣0.75～2.00 min之間只有樹豆酮酸A的色譜峰較明顯，無其余相鄰干擾峰，且空白血漿樣品的1.25 min位置上沒有出現(xiàn)色譜峰，該方法專屬性良好。3.1.2 線性關(guān)系、定量下限與檢測(cè)限 結(jié)果表明，該檢測(cè)方法下，樹豆酮酸A在0.05～26 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r均＞0.999 5），定量下限為0.05 μg/mL，檢測(cè)限為0.01 μg/mL。樹豆酮酸A在不同種屬血漿中的回歸方程及線性范圍見表1。

表1 樹豆酮酸A在不同種屬血漿中的線性關(guān)系Tab 1 Results of linear relationship of cajanonic acid A

3.1.3 精密度與回收率 結(jié)果表明，樹豆酮酸A在大鼠、家兔和人血漿中的回收率為（86.03±2.36）%～（103.80±1.32）%，日內(nèi)和日間RSD均＜10%（n＝5），符合生物樣品分析方法要求。精密度與回收率結(jié)果見表2。3.1.4 基質(zhì)效應(yīng) 結(jié)果表明，樹豆酮酸A在大鼠、家兔和人血漿中的基質(zhì)效應(yīng)為（91.16±5.89）%～（104.70±4.73）%，可見該方法基質(zhì)效應(yīng)小，具有特異、專屬地測(cè)定分析該待測(cè)物的能力?；|(zhì)效應(yīng)結(jié)果見表3。

表2 精密度與回收率結(jié)果（n＝5）Tab 2 Results of precision and recovery（n＝5）

表3 基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果（±s，n＝6）Tab 3 Results of matrix effects（±s，n＝6）

表3 基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果（±s，n＝6）Tab 3 Results of matrix effects（±s，n＝6）

血漿樣品大鼠家兔人基質(zhì)效應(yīng)，%2.5 μg/mL 92.42±5.42 101.30±6.11 91.26±5.89 5 μg/mL 104.70±4.73 96.54±4.29 99.62±4.26 20 μg/mL 98.39±5.24 103.50±4.86 102.10±3.63

3.1.5 穩(wěn)定性 結(jié)果表明，穩(wěn)定性試驗(yàn)中含量的RSD均＜10%（n＝5），可見該方法穩(wěn)定性較好，符合生物樣品分析方法要求。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab 4 Results of stability tests（n＝5）

3.2 血漿蛋白結(jié)合率

結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度的樹豆酮酸A在同一種屬血漿中的血漿蛋白結(jié)合率差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），中、高質(zhì)量濃度的樹豆酮酸A與同一種屬血漿的血漿蛋白結(jié)合率高于低質(zhì)量濃度。在低質(zhì)量濃度時(shí)，樹豆酮酸A在大鼠血漿與人血漿中的血漿蛋白結(jié)合率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），均低于在家兔血漿中的血漿蛋白結(jié)合率（P＜0.05）；在中、高質(zhì)量濃度時(shí)，樹豆酮酸A在3個(gè)種屬血漿中血漿蛋白結(jié)合率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。樹豆酮酸A在不同種屬血漿中的蛋白結(jié)合率見表5。

表5 樹豆酮酸A在不同種屬血漿中的蛋白結(jié)合率（±s，n＝3）Tab 5 Protein binding rate of cajanonic acid A with different species of plasma（±s，n＝3）

表5 樹豆酮酸A在不同種屬血漿中的蛋白結(jié)合率（±s，n＝3）Tab 5 Protein binding rate of cajanonic acid A with different species of plasma（±s，n＝3）

注：與家兔比較，＊P＜0.05Note：vs.rabbits，＊P＜0.05

血漿樣品大鼠家兔人血漿蛋白結(jié)合率，%20 μg/mL 99.42±0.01 99.42±0.03 99.37±0.01 2.5 μg/mL 75.63±0.90＊79.61±1.08 76.74±1.22＊5 μg/mL 98.30±0.03 98.48±0.10 97.99±0.11

4 討論

研究藥物血漿蛋白結(jié)合率的方法有多種，其中超濾法和平衡透析法是較為經(jīng)典、常用的方法[10]。平衡透析法是研究藥物血漿蛋白結(jié)合率的經(jīng)典方法，該法較簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、受實(shí)驗(yàn)因素干擾小，但平衡透析法有透析平衡時(shí)間較長(zhǎng)（通常37℃靜置透析需要12～48 h達(dá)擴(kuò)散平衡）、極易受血漿和緩沖液的pH影響以及透析設(shè)備表面可能會(huì)非特異性藥物吸附效應(yīng)等缺點(diǎn)[11]。而超濾法操作簡(jiǎn)便、測(cè)定快速、生物樣品量少，能減少設(shè)備表面非特異性的吸附，考慮到以上原因，本研究選擇超濾法測(cè)定樹豆酮酸A的血漿蛋白結(jié)合率。此外，孵育液中混有磷酸鹽及蛋白、超濾液中可能殘余有磷酸鹽及少量蛋白，會(huì)堵塞離子阱質(zhì)譜的傳輸毛細(xì)管，因此采用甲醇沉淀蛋白法，再用乙酸乙酯萃取對(duì)其進(jìn)行前處理。樹豆酮酸A在4℃、室溫及37℃下12 h內(nèi)皆穩(wěn)定，RSD均＜10%，因此在37℃下孵育及用氮?dú)鈱⑵浯蹈蓪?duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無影響。預(yù)實(shí)驗(yàn)考察過樹豆酮酸A血漿樣品在37℃下孵育60 min，樹豆酮酸A與血漿蛋白的結(jié)合已達(dá)到平衡狀態(tài)。還應(yīng)注意，用pH 7.4的PBS制備的樹豆酮酸A應(yīng)該即配即用，以防止因久置而使樹豆酮酸A在PBS中發(fā)生轉(zhuǎn)化。

本研究采用超濾法結(jié)合UPLC-MS/MS法測(cè)定2.5、5、20 μg/mL 3個(gè)質(zhì)量濃度的樹豆酮酸A在大鼠、家兔和人血漿中的血漿蛋白結(jié)合率，質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL時(shí)，在大鼠、家兔和人血漿的蛋白結(jié)合率分別為（75.63±0.90）%、（79.61±1.08）%、（76.74±1.22）%；質(zhì)量濃度為5 μg/mL時(shí)的血漿蛋白結(jié)合率均在98%左右；質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)的血漿蛋白結(jié)合率均在99%左右。結(jié)果表明，各質(zhì)量濃度樹豆酮酸A與人血漿和大鼠血漿的蛋白結(jié)合率皆無明顯差異，但在低質(zhì)量濃度時(shí)在家兔血漿中的蛋白結(jié)合率明顯高于大鼠和人。在新藥研發(fā)早期階段，可通過表征其在體外血漿蛋白結(jié)合率的情況，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人進(jìn)行不同種屬間的結(jié)合率差異比較研究，為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推至人體提供有益參考。本研究為進(jìn)一步的臨床前藥效、藥動(dòng)和毒理研究中模型動(dòng)物的選擇提供了參考依據(jù)。

樹豆酮酸A與血漿蛋白的結(jié)合具有濃度依賴性，藥物濃度升高其血漿蛋白結(jié)合率隨之升高，藥物高濃度時(shí)結(jié)合率達(dá)到99%以上，這可能與藥物的理化性質(zhì)及血漿蛋白的結(jié)合性質(zhì)有關(guān)。具有濃度依賴性或高血漿蛋白結(jié)合的藥物臨床使用需注意控制劑量，防止因藥物與血漿蛋白結(jié)合而達(dá)不到有效血藥濃度，更需注意的是，高血漿蛋白結(jié)合的藥物臨床使用易產(chǎn)生安全性問題，一旦有影響血漿蛋白結(jié)合的因素產(chǎn)生，例如與其他高血漿蛋白結(jié)合率藥物聯(lián)合用藥時(shí)，游離藥物濃度則可能成倍增加，造成藥物副作用或毒性[12]。本研究結(jié)果顯示，樹豆酮酸A有很強(qiáng)的血漿蛋白結(jié)合率，所以在接下來的研究中需選擇在臨床有可能聯(lián)合用藥的高血漿蛋白結(jié)合率藥物進(jìn)行體外藥物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)[13]，以考察其對(duì)樹豆酮酸A蛋白結(jié)合率的影響，保證人體用藥安全。