白屈菜堿對活化后大鼠肝星狀細胞CFSC-8B的增殖、膠原合成及TGF-β1受體的影響Δ

李曉明，林鵬飛，董妙先，徐天嬌，于春磊，榮華，王曉麗#（.齊齊哈爾醫學院醫藥科學研究院，黑龍江齊齊哈爾 6006；.齊齊哈爾醫學院藥學院，黑龍江齊齊哈爾 6006）

肝星狀細胞（Hepatic stellate cells）是一種位于肝臟的非實質細胞，肝星狀細胞的活化、增殖是肝纖維化發生過程中結締組織異常增生、肝內細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）過度沉積的主要原因[1-2]。研究顯示，肝纖維化發生后，若能經過積極的方法干預，抑制肝星狀細胞的活化、增殖，肝纖維化的病理改變能發生可逆性恢復，從而避免肝纖維化進一步惡化為肝硬化，甚至肝癌[3-4]。因此，尋找一種能有效控制肝星狀細胞活化、增殖的藥物，對降低肝硬化和肝癌發病率具有重要意義。中藥白屈菜為罌粟科白屈菜屬多年生草本植物白屈菜（Chelidonium majusL.）的全草，花盛期割取地上部分，曬干或鮮用。其味苦，性涼，有毒，主要活性成分為白屈菜堿（Chelidonine）、原阿片堿、白屈菜紅堿等生物堿，具有抗菌、鎮痛、興奮平滑肌作用，白屈菜治療各種腫瘤在民間也廣為流傳，對多種腫瘤具有一定的抑制效果[5]。但關于白屈菜堿抑制肝纖維化的研究未見報道。筆者前期研究結果發現，白屈菜中活性成分白屈菜紅堿可抑制肝纖維化小鼠的病理學改變[6]，而白屈菜堿也是白屈菜中活性成分之一，因此，本文以轉化生長因子β1（TGF-β1）活化大鼠肝星狀細胞CFSC-8B為肝纖維化模型，觀察白屈菜堿對TGF-β1活化后CFSC-8B的增殖和膠原合成的影響。

1 材料

1.1 儀器

UV-2550型紫外分光光度計、CKX41型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Countess C10227型細胞計數器（美國Invitrogen公司）；3111型二氧化碳培養箱（美國Thermo公司）；ELX800型全自動酶標儀（美國Bio-Tek公司）；5417R型離心機（德國Eppendorf公司）；Stratagene Mx3005P型實時定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國Agilent公司）；HL-2000型分子雜交箱（美國UVP公司）；JY-ZY2型轉移電泳槽和JY-CZ1型單垂直電泳槽（北京君意東方電泳設備有限公司）；SmartChemiⅡ型一體式微型化學發光成像儀（北京賽智創業科技有限公司）；XPE504型分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

白屈菜堿對照品（上海鼓臣生物技術有限公司，批號：18041303，純度：≥98%）；秋水仙堿片（西雙版納藥業有限責任公司，批號：H53021369，規格：0.5 mg）；TRIzol試劑（美國Ambion公司）；實時熒光定量PCR試劑盒與逆轉錄試劑盒（寶生物工程大連有限公司）；TGF-β1（批號：SF7926，純度：98%）、細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒均由上海碧云天生物技術有限公司提供；兔抗鼠TGF-β1受體（TβR）-Ⅰ多克隆抗體（美國Cell Signaling公司，批號：3）；兔抗鼠TβR-Ⅱ多克隆抗體（美國Santa Cruz公司，批號：F1915）；兔抗鼠磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（美國Sigma公司，批號：106M4851V）；山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（北京康為世紀生物科技有限公司，批號：00051405）；ECL超敏發光檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ引物（上海生工生物工程有限公司合成）；羥脯氨酸（Hydroxyproline，Hyp）試劑盒、CCK-8細胞活力檢測試劑盒、Ⅰ型膠原蛋白（Col-Ⅰ）和Ⅲ型膠原蛋白（Col-Ⅲ）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 細胞

大鼠肝星狀細胞CFSC-8B購自賽百慷（上海）生物技術股份有限公司。

2 方法與結果

2.1 CFSC-8B細胞的培養與分組

用完全培養基培養大鼠肝星狀細胞CFSC-8B，于37℃含5%CO2飽和濕度培養箱內孵育傳代培養，取對數生長期細胞用于試驗，以5×105mL－1接種于96孔板中，每孔加入100 μL。試驗分為正常對照組、模型組、溶劑組（乙醇）、陽性對照組（1 μg/mL秋水仙堿乙醇溶液）和白屈菜堿低、中、高濃度組（2.1、4.2、8.4 μg/mL白屈菜堿乙醇溶液），每組3個復孔，各組加入藥物濃度依據前期試驗研究結果設定。模型組細胞中加入20 μg/L的TGF-β1作用 24 h 進行活化，促使肝纖維化[7]，白屈菜堿低、中、高濃度組分別加入20 μg/L的TGF-β1和相應質量濃度的白屈菜堿乙醇溶液共同作用24 h，溶劑組加入20 μg/L的TGF-β1和乙醇溶液共同作用24 h，陽性對照組加入20 μg/L的TGF-β1和1 μg/mL秋水仙堿乙醇溶液共同作用24 h，正常對照組不加藥物及TGF-β1。

2.2 CCK-8法檢測細胞增殖

藥物處理24 h后，按照CCK-8細胞活力檢測試劑盒說明書中方法，在各孔中加入CCK-8溶液10 μL，37℃孵育2 h，置于酶標儀中，設定檢測波長為450 nm，測定吸光度，計算細胞增殖率：細胞增殖率（%）＝（正常對照孔的吸光度－加藥孔的吸光度）/（正常對照孔的吸光度－空白孔的吸光度）×100%，式中空白孔只含有培養基和CCK-8，不含細胞和藥物。

2.3 酶消化法檢測細胞上清液中Hyp含量

藥物處理24 h后，吸取細胞上清液，按照Hyp試劑盒說明書中方法進行消化操作后，置于酶標儀中，設定檢測波長為550 nm，測定吸光度，計算上清液中Hyp含量。

2.4 ELISA法檢測細胞上清液中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平

藥物處理24 h，按照Col-Ⅰ和Col-ⅢELISA試劑盒說明書中方法處理上清液，置于酶標儀中，設定檢測波長為450 nm，測定吸光度，計算上清液中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平。

2.5 Western blot法檢測細胞中TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ蛋白的表達

藥物處理24 h后，參照文獻處理方法[8]，收集細胞，加入裂解液，按照試劑盒說明書操作提取CFSC-8B細胞總蛋白，采用二喹啉甲酸（BCA）法定量蛋白濃度，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），進行蛋白分離，濕轉法轉至偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h。加入兔抗鼠TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ和GAPGH多克隆抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜，次日TBST緩沖液洗膜3次，再加入山羊抗兔IgG二抗（1∶1 000）37℃孵育2 h。利用ECL超敏發光檢測試劑盒檢測，一體式微型化學發光成像儀掃描，分析各蛋白質印跡條帶的光密度，以目標蛋白與內參（GAPDH）光密度的比值計算目標蛋白的表達量，再與正常對照組的比值計算目標蛋白的相對表達量。

2.6 實時熒光定量-PCR法檢測細胞中α-SMA、TβR-Ⅰ和TβR-ⅡmRNA的表達

藥物處理24 h后，收集細胞，根據RNA提取試劑盒說明書中方法提取細胞總RNA，各取1 μg總RNA進行逆轉錄，獲得cDNA。再以cDNA為模板，依照實時熒光定量-PCR試劑盒說明書操作進行PCR反應，檢測細胞中α-SMA、TβR-Ⅰ和TβR-Ⅱ mRNA的表達。反應條件：95℃預變性4 min；95℃變性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環40次。以GAPDH作為內參基因，采用2－ΔΔct法計算細胞中α-SMA、TβR-Ⅰ和TβR-Ⅱ mRNA相對表達量。引物序列及片斷長度見表1。

表1 引物序列及片斷長度Tab 1 Primer sequence and fragment length

2.7 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行統計分析。計量資料以±s表示。用單因素方差分析進行多組間差異顯著性比較，采用SNK檢驗進行組間兩兩比較。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 白屈菜堿對CFSC-8B細胞增殖的影響

與正常對照組比較，模型組細胞增殖率顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組和白屈菜堿中、高濃度組細胞增殖率顯著降低（P＜0.05），并且白屈菜堿高濃度組細胞增殖率降低程度較中濃度組更顯著（P＜0.05）；白屈菜堿低濃度組細胞增殖率無明顯變化（P＞0.05）。因白屈菜堿低濃度組細胞增殖率無明顯變化，故僅選用白屈菜堿中、高濃度組進行后續試驗。各組細胞增殖率測定結果見圖1。

圖1 各組細胞增殖率測定結果（±s，n＝10）Fig 1 Results of cell proliferation rate in each group（±s，n＝10）

3.2 白屈菜堿對CFSC-8B細胞上清液中Hyp、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平的影響

與正常對照組比較，模型組細胞上清液中Hyp、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組和白屈菜堿中、高濃度組細胞上清液中Col-Ⅰ水平顯著降低（P＜0.05），白屈菜堿高濃度組和陽性對照組細胞上清液中Hyp、Col-Ⅲ水平顯著降低（P＜0.05）。與白屈菜堿中濃度組比較，白屈菜堿高濃度組細胞上清液中Col-Ⅰ水平顯著降低（P＜0.05），Hyp、Col-Ⅲ水平有所下降，但差異無統計學意義（P＞0.05）。各組細胞上清液中Hyp、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平測定結果見表2。

表2 各組細胞上清液中Hyp、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平測定結果（x±s，n＝6）Tab 2 Results of levels determination of Hyp，Col-Ⅰ and Col-Ⅲ in cell supernatant of each group（±s，n＝6）

表2 各組細胞上清液中Hyp、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平測定結果（x±s，n＝6）Tab 2 Results of levels determination of Hyp，Col-Ⅰ and Col-Ⅲ in cell supernatant of each group（±s，n＝6）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與白屈菜堿中濃度組比較，ΔP＜0.05Note：vs.normal control group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs.chelidonine medium concentration group，ΔP＜0.05

Col-Ⅲ，μg/L 23.51±1.62 40.43±2.66＊40.27±2.17 37.57±2.57 34.14±1.97#28.71±1.81#組別正常對照組模型組溶劑組白屈菜堿中濃度組白屈菜堿高濃度組陽性對照組Hyp，mg/L 1.85±0.10 2.94±0.20＊2.94±0.18 2.67±0.18 2.42±0.14#2.23±0.19#Col-Ⅰ，μg/L 13.83±0.85 24.91±1.45＊25.08±1.86 21.43±1.35#18.62±1.39#Δ 16.29±1.20#

3.3 白屈菜堿對CFSC-8B細胞中TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組細胞中TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組和白屈菜堿中、高濃度組細胞中TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。與白屈菜堿中濃度組比較，白屈菜堿高濃度組細胞中TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。各組細胞中TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ蛋白表達的電泳圖見圖2，測定結果見圖3。

圖2 各組細胞中TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ蛋白表達的電泳圖Fig 2 Electropherogram of protein expression of TβR-Ⅰand TβR-Ⅱ in cells of each group

圖3 各組細胞中TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ蛋白表達測定結果（n＝3）Fig 3 Results of protein expression of TβR-Ⅰ andTβR-Ⅱ in cells of each group（n＝3）

3.4 白屈菜堿對CFSC-8B細胞中α-SMA、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ mRNA表達的影響

與正常對照組比較，模型組細胞中α-SMA、TβR-Ⅰ、TβR-ⅡmRNA表達顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組和白屈菜堿中、高濃度組細胞中α-SMA、TβR-Ⅰ、TβR-ⅡmRNA表達顯著降低（P＜0.05）。與白屈菜堿中濃度組比較，白屈菜堿高濃度組細胞中TβR-Ⅰ、TβR-ⅡmRNA表達顯著降低（P＜0.05）；α-SMA mRNA表達有所下降，但差異無統計學意義（P＞0.05）。各組細胞中α-SMA、TβR-Ⅰ、TβR-ⅡmRNA相對表達量測定結果見表3。

表3 各組細胞中α-SMA、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ mRNA相對表達量測定結果（x±s，n＝3）Tab 3 Results of mRNA expressions of α-SMA，TβR-Ⅰand TβR-Ⅱ in cells of each group（x±s，n＝3）

4 討論

活化的肝星狀細胞是引發肝纖維化的細胞學基礎，在肝纖維化病變過程中扮演重要角色[9]。當肝臟受到損傷、炎癥等各種致病因素的作用時，處于靜止期的肝星狀細胞被激活，轉化成為肌成纖維樣細胞。肌成纖維樣細胞分泌多種促炎因子和促纖維化因子，細胞中α-SMA合成增加并產生大量以Col-Ⅰ、Col-Ⅲ為主的ECM成分，并在肝臟內過度沉積，形成肝纖維化[10]。可見，觀察Col-Ⅰ、Col-Ⅲ含量變化，是評價肝星狀細胞活化、增殖以及膠原蛋白合成的重要依據。Hyp是膠原組織代謝的重要產物，且為膠原中特有的氨基酸，觀察Hyp含量變化，對于判斷肝星狀細胞的增殖、ECM的沉積、肝纖維化的程度具有重要意義[11]。因此本研究檢測了外源性TGF-β1活化的肝星狀細胞的增殖、Hyp含量和Col-Ⅰ、Col-Ⅲ水平，結果顯示，TGF-β1誘導活化的肝星狀細胞，通過白屈菜堿干預后，當白屈菜堿質量濃度為4.2、8.4 μg/mL時，與模型組比較，細胞增殖率顯著降低（P＜0.05），而白屈菜堿質量濃度為2.1 μg/mL時細胞增殖率差異無統計學意義（P＞0.05），因此在后續試驗中只保留白屈菜堿的4.2、8.4 μg/mL（中、高）濃度組。模型組細胞中Hyp含量、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平較正常對照組顯著升高，說明本研究中肝星狀細胞活化成功。而與模型組比較，白屈菜堿中濃度組細胞中Col-Ⅰ含量顯著降低（P＜0.05），Col-Ⅲ及Hyp含量差異無統計學意義（P＞0.05）；白屈菜堿高濃度組細胞中Hyp含量、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平均顯著降低，說明白屈菜堿能夠抑制大鼠肝星狀細胞的增殖和膠原合成。

TGF-β1是公認的重要的致纖維化因子，在肝纖維化的形成、發展中起著重要的作用[12]。其通過促進肝星狀細胞活化、增殖，產生前膠原mRNA，使肝星狀細胞失去脂質液滴，逐漸向肌成纖維樣細胞和成纖維細胞的轉化，促進膠原蛋白的合成與沉積，并最終導致肝纖維化[13]。De Bleser PJ等[14]研究發現，TGF-β1在激活的肝星狀細胞中的表達量是靜止時的12倍，而外源性TGF-β1又可以促進肝星狀細胞的活化，刺激肝星狀細胞持續合成ECM。TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ是具有絲蘇氨酸激酶活性的轉膜蛋白，由胞外區、胞內區和跨膜區組成，在細胞膜表面具有高親和力，同屬TβR的亞型，在組織中分布最為廣泛[15]。TβR-Ⅰ的胞內側富含高度保守的絲氨酸-甘氨酸序列（GS）區域，是 TβR-Ⅰ特有的，而TβR-Ⅱ的胞內側含有絲氨酸-蘇氨酸激酶功能區，具有磷酸化功能[16]。活化的TGF-β1首先結合TβR-Ⅱ，形成異聚體復合物，然后寡集并磷酸化TβR-Ⅰ，使絲氨酸-蘇氨酸殘基立體構像改變，從而具有激酶活性，激活胞內信號分子Smads蛋白，繼續TGF-β1的信號轉導[17]。因此本研究用TGF-β1活化肝星狀細胞，觀察白屈菜堿對大鼠肝星狀細胞TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ表達的干預作用。本研究顯示，與正常對照組比較，模型組細胞中TβR-Ⅰ、TβR-ⅡmRNA表達和TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ的蛋白表達顯著升高；與模型組比較，白屈菜堿中、高濃度組細胞中TβR-Ⅰ、TβR-ⅡmRNA表達和TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ的蛋白表達顯著降低。

以上結果表明，白屈菜堿對TGF-β1活化的肝星狀細胞具有一定的增殖抑制作用，進而說明其具有逆轉肝纖維化的作用。白屈菜堿為白屈菜的主要活性成分之一，因此，白屈菜可能成為臨床治療肝纖維化的潛在中藥。通過本研究，旨在為白屈菜在臨床應用提供理論依據，同時為中藥的現代化奠定基礎。對于白屈菜堿抗纖維化作用機制還需進一步的研究。