HPLC法測定福多司坦原料藥及其制劑中有關物質的含量Δ

郭志淵，趙欣慶，朱恒怡，袁 軍（四川省食品藥品檢驗檢測院，成都 611731）

福多司坦于1988年由日本SS制藥株式會社研發創制，1990年與同仁醫藥化工株式會社開展臨床試驗[1-2]，2001年12月7日首次在日本上市[3]。福多司坦作為一類高效祛痰藥物[4]，應用前景較好。目前，國內制備福多司坦原料藥的工藝有2種，一種是鹽酸半胱氨酸與烯丙醇反應制得[5]，另一種是鹽酸半胱氨酸與3-鹵代-1-丙醇反應制得[6]。國內上市的福多司坦口服固體制劑有片劑、膠囊劑及顆粒劑。

在福多司坦原料藥及其制劑現行標準[7-9]中，有關物質檢測方法雖各不相同，但均僅控制了未知雜質及福多司坦右旋異構體。然而，根據化學藥物雜質研究的技術指導原則[10]要求，無論原料或制劑含量大于鑒定閾值的雜質都應進行鑒定，明確雜質的結構并對其限度進行研究。在2018年仿制藥一致性評價中，為了區分福多司坦各仿制藥工藝的差異及質量的優劣，筆者收集了相關文獻[11-14]報道的福多司坦中的檢測出的有關雜質，如半胱氨酸（雜質A）、胱氨酸（雜質B）、福多司坦亞砜（雜質C）、（2R，2'R）-3，3'-（丙基-1，3-二硫代）雙（二氨基丙酸）（雜質E）、（-）-（R）-2-（3-羥丙基）氨基-3-（3-羥丙基硫代）丙酸（雜質F）、（-）-（R）-2-氨基-3-（3-氯丙基硫代）丙酸（雜質G），并采用高效液相色譜（HPLC）外標法及加校正因子的主成分自身對照法對福多司坦原料藥及其仿制藥生產企業生產的片劑、膠囊劑中的這些雜質進行定量分析，以期為福多司坦仿制藥一致性評價提供參考。福多司坦及其雜質結構式見圖1。

圖1 福多司坦及其雜質結構式Fig 1 Structures of fudosteine and its impurities

1 材料

1.1 儀器

2695 HPLC儀（美國Waters公司）；1260 HPLC儀（美國Agilent公司）；CPA225D電子天平、A8000多參數測量酸度計（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 藥品與試劑

福多司坦對照品（批號：100920-201802，純度：99.5%）、雜質B對照品（批號：140632-200502，純度：99.3%）均購自中國食品藥品檢定研究院；雜質A對照品（加拿大TRC公司，批號：2-MJJ-156-1，純度：97.0%）；雜質C對照品（美國CRTO公司，批號：C4X-14471-1709，純度：98.7%）；雜質E對照品（批號：WS-T170608X，純度：95.9%）、雜質F對照品（批號：WS-T170110Z-1，純度：95.6%）、雜質G對照品（批號：ES7818-4-P1，純度：94.4%）均由本實驗室自制；福多司坦原料藥1（A企業，批號：FD160871，純度：99.2%）；福多司坦原料藥2（批號：160806008，純度：99.9%）、福多司坦膠囊2（批號：160910056，規格：0.2 g）均購自B企業；福多司坦原料藥3（批號：H160404，純度：99.4%）、福多司坦片1（批號：B160201161，規格：0.2 g）、福多司坦膠囊 1（批號：1607001，規格：0.2 g）均購自C企業；福多司坦原料藥4（D企業，批號：160309-1，純度：99.1%）；福多司坦原料藥5（批號：1610001，純度：99.9%）、福多司坦片2（批號：057170101，規格：0.2 g）均購自E企業；福多司坦片3（F企業，批號：1607201，規格：0.2 g）、福多司坦片4（G企業，批號：160702，規格：0.2 g）、福多司坦膠囊3（H企業，批號：1606003，規格：0.2 g）；己烷磺酸鈉、乙腈為色譜純，磷酸、磷酸二氫鉀等為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜條件1（用于檢測雜質A、B、C）：色譜柱為MGⅡC18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.12%己烷磺酸鈉溶液（pH 2.0），流速為1.0 mL/min，檢測波長為210 nm，柱溫為35℃，進樣量為20 μL。

色譜條件2（用于檢測雜質E、F、G和其他未知雜質）：色譜柱為Altech Altima C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（A）-乙腈（B）-水（C），梯度洗脫，流速為0.5 mL/min，檢測波長為200 nm，柱溫為30℃，進樣量為20 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.2 溶液的制備

2.2.1 雜質對照品溶液的制備 （1）雜質A、B、C混合對照品溶液：精密稱取雜質A、B、C對照品適量，加0.12%己烷磺酸鈉溶液溶解并稀釋制成各雜質質量濃度均為100 μg/mL的對照品溶液。（2）福多司坦及雜質E、F、G混合對照品溶液：精密稱取福多司坦對照品及雜質E、F、G對照品適量，加0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋制成福多司坦及雜質E、F、G質量濃度均為100 μg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取福多司坦原料藥或其制劑內容物100 mg，分別置于50 mL量瓶中，加0.12%己烷磺酸鈉溶液或0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，分別作為供試品溶液1、2。

2.2.3 自身對照溶液的制備 精密量取“2.2.2”項下供試品溶液0.1 mL，分別置于100 mL量瓶中，加0.12%己烷磺酸鈉溶液或0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，分別作為自身對照溶液1、2。

2.2.4 系統適用性試驗溶液 取福多司坦及雜質A、B、C對照品適量，加0.12%己烷磺酸鈉溶液制成每1 mL含福多司坦2 mg和雜質A、B、C各2 μg的溶液作為系統適用性溶液1；取福多司坦與雜質E、F、G對照品適量，加“2.1”項下0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液制成每1 mL含福多司坦2 mg和雜質E、F、G各2 μg的溶液作為系統適用性溶液2。

2.2.5 空白輔料溶液 將各廠家福多司坦片、膠囊的輔料按配方量混合，并稱取相當于最大片質量1/2的輔料量置于50 mL量瓶中，分別用0.12%己烷磺酸鈉溶液或0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液溶解作為空白輔料溶液1、2。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統適用性試驗 精密量取“2.2.4”項下的系統適用性溶液1、2，分別按“2.1”項下色譜條件1、2進樣分析，記錄色譜圖。結果，空白輔料峰無干擾，福多司坦峰與各雜質峰間無干擾，分離度均＞1.5，各雜質峰理論板數均＞3 000，雜質E、F、G的相對保留時間為0.88、1.95、3.08。系統適用性色譜圖見圖2。

圖2 系統適用性試驗色譜圖Fig 2 Chromatograms of system suitability test

2.3.2 專屬性試驗 取福多司坦片（批號：B160201161），研磨成細粉，取福多司坦粉末100 mg，分別置于50 mL量瓶中，共6份，一份為未破壞樣品，另5份按以下條件進行破壞。（1）酸破壞：加1 mol/L鹽酸溶液5 mL，水浴加熱30 min，放冷后，加1 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL中和，然后用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，續濾液作為酸破壞樣品。（2）堿破壞：加1 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL，水浴加熱30 min，放冷后，加1 mol/L鹽酸溶液5 mL中和，然后用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，續濾液作為堿破壞樣品。（3）高溫破壞：加水適量溶解后，置于105 ℃下加熱30 min，然后用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，續濾液作為高溫破壞樣品。（4）光照破壞：加水適量溶解后，置于紫外燈（波長254 nm）下照射2 d后，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，續濾液作為光照破壞樣品。（5）氧化破壞：加10%過氧化氫溶液1 mL，立即用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，續濾液作為氧化破壞樣品。取上述6種樣品20 μL，按“2.1”項下色譜條件1、2進樣分析，記錄色譜圖。結果，在不同破壞條件下，各降解產物峰均能與主峰完全分離，表明該方法專屬性良好。專屬性試驗色譜圖見圖3。

2.3.3 線性關系及校正因子考察 分別取“2.2.1（1）”項下對照品溶液適量，加0.12%己烷磺酸鈉溶液稀釋制成每1 mL中含雜質A、B、C均為0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、10.0、20.0 μg的系列溶液；另取“2.2.1（2）”項下對照品溶液適量，加0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋制成每1 mL中含福多司坦和雜質E、F及G均為0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、10.0 μg的系列溶液。精密吸取上述溶液20 μL，按“2.1”項下色譜條件1、2進樣分析，記錄峰面積。以福多司坦或各雜質質量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸，并以方程斜率（K）計算雜質E、F、G的校正因子（校正因子＝K福多司坦/K雜質E/F/G），線性關系及校正因子考察結果見表2。

表2 線性關系及校正因子Tab 2 Linear relationships and correction factors

2.3.4 精密度試驗 取“2.3.3”項下質量濃度為1.0 μg/mL的各雜質溶液，按“2.1”項下色譜條件1、2連續進樣6次，記錄福多司坦及各雜質的峰面積。結果，福多司坦及各雜質峰面積的RSD均小于1.2%（n＝6），表明該方法精密度良好。

2.3.5 檢測限與定量限考察 取“2.2.1”項下福多司坦及各雜質的對照品溶液，逐級稀釋，按“2.1”項下色譜條件1、2進樣分析。以信噪比為3∶1計算檢測限，以信噪比為10∶1計算定量限。結果，福多司坦及雜質A、B、C、E、F、G的檢測限分別為2.06、5.57、1.01、1.99、2.22、4.21、4.43 ng，定量限分別為4.12、11.14、2.02、3.98、4.45、8.42、8.85 ng。

圖3 專屬性試驗色譜圖Fig 3 Chromatograms of specific test

2.3.6 穩定性試驗 取“2.2.4”項下系統適用性溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、24 h后按“2.1”項下色譜條件1、2進樣分析，記錄峰面積。結果，雜質A在4 h內峰面積的RSD＜2.0%（n＝3），福多司坦及雜質B、C、E、F、G在24 h內峰面積的RSD均＜1.0%（n＝7），表明該方法穩定性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗 分別精密量取“2.2.1”項下各雜質混合對照品溶液適量，置于已稱有一定空白輔料和福多司坦原料藥5的量瓶中，制備相當于雜質含量20%、100%、150%的供試品溶液，每個濃度各3份，取上述供試品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件1、2進樣分析，記錄峰面積，雜質A、B、C按外標法計算各雜質回收率，雜質E、F、G按加校正因子的主成分自身對照法計算各雜質加樣回收率。結果，雜質A、B、C、E、F、G平均加樣回收率分別為98.0%、97.3%、102.4%、99.4%、98.9%、96.4%，RSD分別為1.4%、1.5%、1.1%、0.9%、1.2%、0.5%（n＝9）。

2.3.8 樣品中各雜質含量檢測 分別取各生產企業的原料藥或制劑樣品適量，按“2.2.2”項下制備樣品溶液，然后取該樣品溶液按“2.2.3”項下方法制備自身對照溶液，然后取上述溶液適量，分別按“2.1”項下色譜條件1、2進樣分析，記錄峰面積。雜質A、B、C按外標法計算其在樣品中的含量，雜質E、F、G按加校正因子的主成分自身對照法計算其在樣品中的含量，由于樣品中還有其他未知雜質，因此，筆者采用自身對照法[15]對其他未知雜質含量進行測定。樣品中各雜質含量檢測結果見表3。

表3 樣品中各雜質含量檢測結果（%%）Tab 3 Results of content determination of the impurities in samples（%%）

3 討論

3.1 色譜系統選擇

福多司坦各雜質極性相差較大，其中雜質A、B、C的極性較大，在低pH的0.12%己烷磺酸鈉溶液中能夠得到良好分離，但在該色譜條件1下無法將極性較小的雜質E、F、G洗脫出來，故使用極性較小的色譜條件2對其進行分離。福多司坦右旋異構體在標準中有檢測方法，因此，本文沒有再進行研究。

3.2 雜質來源分析

福多司坦中雜質A為起始物料，雜質B為起始物料中的雜質或降解產物，雜質E、F、G為反應副產物，其中雜質G為鹽酸半胱氨酸與3-鹵代-1-丙醇反應的特定副產物，雜質C為福多司坦氧化降解產物。由強制降解試驗可知，福多司坦的主要降解產物為雜質C，在堿降解中還發現了幾個較大的未知降解雜質，但因樣品中均未檢出這幾個雜質，且未制備有相應的對照品，所以此次試驗未對這幾個雜質進行定量研究。

3.3 雜質的限度

由試驗結果可知，在福多司坦原料藥及其制劑中，雜質C、E和G含量較高，約0.1%～0.2%。福多司坦制劑每日最大服用劑量為1.2 g，各雜質為非毒性雜質，根據國家食品藥品監督管理局發布的化學藥物雜質研究的技術指導原則[10]，建議將工藝雜質A、B、E、F、G限度定為0.15%，降解雜質C可適當放寬限度，其他單個未知雜質限度定為0.1%，雜質總量限度定為1.0%。

綜上所述，不同企業福多司坦原料藥中雜質含量存在差異，從而使得其各制劑中有關物質的含量參差不齊。因此，建議仿制藥企業完善福多司坦原料藥有關物質的檢測方法，為其仿制藥一致性評價提供基礎。