消腫止痛液消腫、促潰瘍面愈合、鎮痛的有效部位篩選Δ

王銀潔，劉本臣，劉軍，宮凱敏，賽紀虎，張久存，王宏偉（.銀川市中醫醫院制劑中心，銀川75000；2.廣州中醫藥大學中藥學院，廣州 50006）

消腫止痛液是銀川市中醫醫院（下文簡稱“我院”）制劑（批準文號：寧藥制字Z20140005），主要由地榆、黃柏、大黃、五倍子等八味中藥組成，在我院臨床已應用多年，用于治療各種原因所致的痔瘡初期及外痔、混合痔、肛裂和痔瘡術后的消腫止痛等，治療肛腸疾病術后疼痛水腫的臨床總有效率達93.33%[1]。但由于消腫止痛液為外用洗劑，臨床采用坐浴熏洗的給藥方式，用藥方法較為煩瑣，限制了其使用。考慮到軟膏制劑較易被患者接受，為此，欲將消腫止痛液開發為軟膏制劑。但軟膏制劑存在載藥量小的特點，按原制劑給藥劑量制備軟膏，制劑無法成型（藥物含量過大），故需對其進行有效部位篩選。鑒于此，本研究用大孔樹脂對消腫止痛液進行分離，得到不同極性部位，將分離得到的部位制備為軟膏劑，通過醋酸致大鼠肛周潰瘍（痔瘡模型）實驗、醋酸致小鼠扭體實驗（全身疼痛）、小鼠熱板實驗（局部疼痛）3個藥效實驗篩選消腫止痛液具有消腫、促潰瘍面愈合、鎮痛作用的有效部位，為將其二次開發為軟膏制劑提供參考。

1 材料

1.1 儀器

YLS-6B智能熱板儀（濟南益延科技發展有限公司）；RE-500旋轉蒸發儀（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

1.2 藥品與試劑

消腫止痛液（由我院制劑中心提供，批號：20170706，規格：200 mL，每1 mL含生藥量為0.26 g）；硬脂酸、羥苯乙酯、甘油（湖南爾康制藥股份有限公司，批號：101820150901、103620170605、000120161004）；三乙醇胺（成都華邑藥用輔料制造有限責任公司，批號：20170401）；D101大孔樹脂（安徽三星樹脂科技有限公司）；蒸餾水、乙醇、冰醋酸（四川金山制藥有限公司）。

1.3 動物

SD大鼠120只（♀♂各半，體質量180～220 g）和ICR小鼠260只[♀：200只、♂：60只，體質量均為18～22 g），均由寧夏醫科大學實驗動物中心提供[實驗動物生產許可證號：SCXK（寧）2015-0001]。將大、小鼠飼養于寧夏醫科大學實驗動物中心SPF級動物房中，適應性飼養1周后用于實驗。

2 方法

2.1 消腫止痛液各極性部位的制備

取消腫止痛液若干瓶，濃縮干燥，制備為干膏粉，備用。取適量干膏粉溶于蒸餾水中，上D101大孔樹脂柱[2]，使藥液高于樹脂面約2 cm，靜置吸附12 h，依次用蒸餾水和體積分數分別為20%、40%、60%、95%的乙醇梯度洗脫，每個梯度洗脫5個柱體積，收集并合并相應部位洗脫液，濃縮干燥，得各洗脫部位干粉，水洗脫部位得率為36.61%、20%乙醇洗脫部位得率為10.49%、40%乙醇洗脫部位得率為12.11%、60%乙醇洗脫部位得率為2.44%、95%乙醇洗脫部位得率為0.97%。

2.2 醋酸致大鼠肛周潰瘍實驗

2.2.1 分組、造模與給藥 取SD大鼠120只（♀♂各半）隨機分為正常組（n＝8）和造模組（n＝112）。正常組大鼠不作處理，造模組大鼠采用肛周皮膚注射75%冰醋酸（0.05 mL/只）致肛周潰瘍復制大鼠痔瘡模型[3]。于造模后24 h，進行局部癥狀評分，分值在6分以上認為造模成功[4-5]。將96只造模成功的大鼠隨機分為模型組，陽性組，消腫止痛液高、低劑量組，水以及20%、40%、60%乙醇洗脫部位的高、低劑量組[由于95%乙醇洗脫部位的得率低（0.97%），再加上考慮到原制劑制備工藝為水提，其有效成分在95%乙醇洗脫部位的可能性較低，故未對該部位進行藥效篩選]，每組8只。于造模成功后開始給藥，每天給藥2次（每天9：00 a.m.和1：00 p.m.各給藥1次），連續給藥7 d。全方消腫止痛液臨床給藥劑量以生藥計為27 g/（kg·d），換算為大鼠的給藥劑量以生藥計為2.78 g/（kg·d），本研究采用臨床劑量的3倍劑量和臨床劑量分別作為高、低劑量，即消腫止痛液高、低劑量組和4個洗脫部位高、低劑量組大鼠的給藥劑量均分別為8.34、2.78 g/（kg·d），取適量全方消腫止痛液和各洗脫部位干粉，分別與軟膏基質混合制成含藥軟膏后[6]，按以上劑量于大鼠肛周涂抹給藥；陽性組大鼠肛周涂抹馬應龍麝香痔瘡膏0.51 g/（kg·d）（臨床等效劑量）；正常組、模型組大鼠肛周涂抹等量空白軟膏基質[0.51 g/（kg·d）]。

2.2.2 肛周局部癥狀評分 在給藥第3、7天，分別測量大鼠肛門腫脹程度及潰瘍的長、寬，并計算潰瘍面積，觀察各組大鼠肛周腫脹程度、炎性滲出及潰瘍面積，從這3個方面對局部癥狀進行評分[5]。（1）腫脹程度：0分，無腫脹；1分，勉強可見腫脹；2分，可見邊緣高出皮膚；3分，紅腫隆起≥1 mm。（2）炎性滲出：0分，無炎性滲出；1分，有少許炎性滲出；2分，有炎性滲出；3分，炎性滲出多。（3）潰瘍面積：0分，無潰瘍面積；1分，潰瘍面積≤0.2 cm2；2分，潰瘍面積 0.2～0.3 cm2；3分，潰瘍面積≥0.3 cm2。以上3個方面指標評分相加即為最終評分結果。

2.2.3 肛周局部黏膜組織病理形態觀察 在給藥第7天進行局部評分后，將大鼠處死，取各組大鼠肛周組織，固定于10%中性緩沖福爾馬林溶液中，脫水，石蠟包埋，切片（4 μm），蘇木素-伊紅（HE）染色，進行病理學檢查。病理學檢查在我院病理科進行。參考中華中醫藥學會中藥實驗藥理專業委員會2017年頒布的《中藥痔瘡動物模型制備規范（草案）起草說明》中的“痔瘡局部黏膜組織病理觀察分級參考標準”進行病理評分[3]，評分標準為：-，0分；+，1分；++，2分；+++，3分。“痔瘡局部黏膜組織病理觀察分級參考標準”具體如下：“-”表示黏膜上皮正常。“+”表示黏膜上皮細胞部分變性；黏膜下有較多中性粒細胞及單核細胞浸潤，間質充血水腫。“++”表示黏膜上皮細胞部分變性脫落，形成小潰瘍；黏膜下有較多中性粒細胞及單核細胞浸潤，偶有小膿腫形成，間質充血水腫；黏膜表面有較多膿細胞、纖維蛋白及壞死的組織碎片。“+++”表示黏膜上皮細胞部分變性壞死脫落，形成較大潰瘍；黏膜下有大量中性粒細胞及單核細胞浸潤，有較多小膿腫形成，炎細胞波及整個肌層，肌纖維部分變性；間質明顯充血、出血、水腫，黏膜表面有大量膿細胞、纖維蛋白及壞死的組織碎片。

2.3 醋酸致小鼠扭體實驗

2.3.1 分組與給藥 取ICR小鼠120只（♀♂各半）隨機分為模型組，陽性組，消腫止痛液高、低劑量組，水以及20%、40%、60%乙醇洗脫部位的高、低劑量組，每組10只。按臨床給藥劑量換算，消腫止痛液的小鼠給藥量以生藥計為5.55 g/（kg·d）。本研究采用臨床劑量的3倍劑量和臨床劑量分別作為高、低劑量，即消腫止痛液高、低劑量組和4個洗脫部位高、低劑量組大鼠的給藥劑量以生藥計均分別為16.65、5.55 g/（kg·d），取適量消腫止痛液及其各部位干粉與軟膏基質配制成含藥軟膏后給藥；模型組小涂抹等量軟膏基質；陽性組小鼠涂抹馬應龍麝香痔瘡膏1.03 g/（kg·d）（臨床等效劑量）。給藥前，將小鼠背部脫毛，經皮給藥，每天給藥2次（每天9：00 a.m.和1：00 p.m.各給藥1次），連續給藥3 d。

2.3.2 鎮痛率測定 末次給藥30 min后，各組小鼠均腹腔注射0.6%冰醋酸，劑量為每只0.2 mL[7-9]，觀察各組小鼠出現扭體反應的時間（扭體潛伏時間）及15 min內出現扭體反應的次數（以小鼠出現腹部內凹、軀干與后肢伸張，臀部高起為扭體反應），計算鎮痛率：鎮痛率（%）＝（模型組平均扭體次數－給藥組平均扭體次數）/模型組平均扭體次數×100%。

2.4 小鼠熱板實驗

2.4.1 分組與給藥 取140只ICR小鼠（♀），調節恒溫裝置使熱板控制在（55±0.5）℃ ，預熱30 min。每次將1只小鼠放在熱板上，記錄其開始舔后足的時間（s），即為此鼠的痛閾值（正常為5～30 s）[10-12]，＜5 s或＞30 s者不用。將正常痛閾值小鼠120只隨機分為模型組，陽性組，消腫止痛液高、低劑量組，水以及20%、40%、60%乙醇洗脫部位的高、低劑量組，每組10只。給藥劑量和給藥方法同“2.3.1”項下。

2.4.2 痛閾值測定 末次給藥30 min后，分別測量各組小鼠痛閾值，若60 s無反應，其痛閾值按60 s計算，計算痛閾提高百分率：痛閾提高百分率（%）＝（給藥后痛閾值－給藥前痛閾值）/給藥前痛閾值×100%。

2.5 統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，配對比較用配對t檢驗（給藥第3天和給藥第7天的局部癥狀評分比較以及給藥前痛閾值和給藥后痛閾值的比較），兩組間比較用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析中的兩兩比較（Dunnett-t檢驗），若方差不齊或數據不符合正態分布，則采用非參數Wilcoxon秩和檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 醋酸致大鼠肛周潰瘍實驗結果

3.1.1 局部癥狀評分結果 與正常組比較，模型組大鼠在給藥第3天和第7天均顯示出肛周腫脹、炎性滲出及具有潰瘍，局部癥狀評分顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，在給藥第3天，陽性組、20%乙醇洗脫部位高劑量組、40%乙醇洗脫部位高劑量組和低劑量組以及60%乙醇洗脫部位高劑量組大鼠肛周潰瘍癥狀均得到改善，局部癥狀評分顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；在給藥第7天，除以上5組外，60%乙醇洗脫部位低劑量組大鼠肛周潰瘍癥狀也得到明顯改善，局部癥狀評分也顯著降低（P＜0.05）。結果提示，20%、40%、60%乙醇洗脫部位可能為消腫止痛液有效部位。各組大鼠給藥后局部癥狀評分結果見表1。

表1 各組大鼠肛周局部癥狀評分結果（±s，n＝8）Tab 1 Scores of local symptoms around the anus of rats in each group（±s，n＝8）

表1 各組大鼠肛周局部癥狀評分結果（±s，n＝8）Tab 1 Scores of local symptoms around the anus of rats in each group（±s，n＝8）

注：與正常組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊ ＊ P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

給藥第7天0.00±0.00 6.75±0.71＊＊2.00±0.76##6.00±0.76 5.88±0.99 6.13±0.64 6.25±0.71 5.63±0.74#5.88±1.13 2.38±0.74##3.00±0.76##5.25±0.89##5.75±0.71#組別正常組模型組陽性組消腫止痛液高劑量組消腫止痛液低劑量組水洗脫部位高劑量組水洗脫部位低劑量組20%乙醇洗脫部位高劑量組20%乙醇洗脫部位低劑量組40%乙醇洗脫部位高劑量組40%乙醇洗脫部位低劑量組60%乙醇洗脫部位高劑量組60%乙醇洗脫部位低劑量組局部癥狀評分給藥第3天0.00±0.00 7.13±0.83＊＊4.63±0.52##6.13±0.99 6.25±1.04 6.75±0.89 6.38±0.92 6.00±0.76#6.13±1.13 4.88±0.83##5.50±0.93#5.88±0.99#6.25±1.28

3.1.2 病理觀察及評分結果 正常組大鼠肛周局部組織無明顯病理形態學改變，黏膜上皮正常。模型組大鼠肛周局部組織皮膚斷裂，黏膜上皮細胞部分變性壞死脫落，黏膜下有大量中性粒細胞及單核細胞浸潤，有較多小膿腫形成，間質明顯充血、出血、水腫，黏膜表面有大量膿細胞、纖維蛋白及壞死的組織碎片符合炎性病理學改變，與文獻報道[3]的大鼠醋酸致肛周潰瘍的痔瘡病理結果相似，且該病理改變與文獻報道的人急性嵌頓性痔的病理形態特征相似[13]。陽性組大鼠黏膜上皮部分細胞變性，黏膜下有少量中性粒細胞及單核細胞浸潤，輕度間質充血水腫。消腫止痛液高、低劑量組大鼠肛周黏膜下有較多中性粒細胞及單核細胞浸潤，黏膜上皮細胞部分變性脫落，黏膜表面有較多膿細胞、纖維蛋白及壞死的組織碎片。水洗脫部位高、低劑量組大鼠肛周局部組織皮膚斷裂，黏膜上皮細胞部分變性壞死脫落，黏膜下有大量中性粒細胞及單核細胞浸潤，有較多小膿腫形成，間質明顯充血、出血、水腫。20%乙醇洗脫部位高、低劑量組大鼠肛周組織黏膜下有較多中性粒細胞及單核細胞浸潤，有較多小膿腫形成，間質明顯充血、出血、水腫。40%乙醇洗脫部位高、低劑量組大鼠黏膜上皮細胞均較為正常，黏膜下有少量中性粒細胞，輕度間質充血水腫和少量血栓形成。60%乙醇洗脫部位高劑量組較模型組有所改善，黏膜上皮細胞變性壞死較少，黏膜下中性粒細胞及單核細胞浸潤，偶有小膿腫形成，間質充血水腫，黏膜表面膿細胞減少等；60%乙醇洗脫部位低劑量組大鼠肛周黏膜上皮細胞有壞死，黏膜下部分中性粒細胞和單核細胞浸潤，偶有血栓，黏膜表面有少量膿細胞。各組大鼠痔瘡局部組織病理形態學觀察結果見圖1。

圖1 各組大鼠肛周局部黏膜組織HE染色病理切片圖（×100）Fig 1 HE staining pathological sections of local mucosa around the anus of rats in each group（×100）

與正常組比較，模型組大鼠痔瘡局部組織黏膜病理評分顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，陽性組、40%乙醇洗脫部位高劑量組和低劑量組以及60%乙醇洗脫部位高劑量組大鼠痔瘡局部組織黏膜病理評分顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），提示40%、60%乙醇洗脫部位可能為消腫止痛液的有效部位。各組大鼠肛周局部黏膜組織病理觀察評分結果見表2。

表2 各組大鼠肛周局部黏膜組織病理觀察評分結果Tab 2 Histopathological score of local mucosa around the anus of rats in each group

3.2 醋酸致小鼠扭體反應實驗結果

與模型組比較，陽性組、20%乙醇洗脫部位高劑量組、40%乙醇洗脫部位高劑量組和低劑量組以及60%乙醇洗脫部位高劑量組小鼠的扭體潛伏時間均顯著延長，15 min內扭體次數均顯著減少（P＜0.05或P＜0.01），這提示消腫止痛液20%、40%、60%乙醇洗脫部位對醋酸所致小鼠疼痛有一定抑制作用。各組小鼠扭體潛伏時間、15 min扭體次數測定結果見表3。

表3 各組小鼠扭體潛伏時間、15 min內扭體次數測定結果（±s，n＝10）Tab 3 Writhing latency time and 15 min writhing times of mice in each group（±s，n＝10）

表3 各組小鼠扭體潛伏時間、15 min內扭體次數測定結果（±s，n＝10）Tab 3 Writhing latency time and 15 min writhing times of mice in each group（±s，n＝10）

注：與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

鎮痛率，%組別模型組陽性組消腫止痛液高劑量組消腫止痛液低劑量組水洗脫部位高劑量組水洗脫部位低劑量組20%乙醇洗脫部位高劑量組20%乙醇洗脫部位低劑量組40%乙醇洗脫部位高劑量組40%乙醇洗脫部位低劑量組60%乙醇洗脫部位高劑量組60%乙醇洗脫部位低劑量組36.13 6.07 5.78 4.34 6.65 17.63 14.45 28.61 24.57 21.10 14.16扭體潛伏時間，s 170.80±30.46 290.90±38.05##193.10±18.43 190.20±20.88 177.10±22.29 183.20±14.70 205.70±17.52#196.30±22.31 284.10±35.28##232.40±18.55##209.40±23.83##196.90±18.75 15 min扭體次數34.60±5.48 22.10±3.90##32.50±5.48 32.60±6.50 33.10±5.59 32.30±3.95 28.50±6.15 29.60±4.58 24.70±4.42##26.10±4.18##27.30±7.92#29.70±5.87

3.3 小鼠熱板實驗結果

與給藥前比較，陽性組、消腫止痛液高劑量組、20%乙醇洗脫部位高劑量組以及40%乙醇洗脫部位高、低劑量組小鼠給藥后痛閾值均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。給藥后，與模型組比較，陽性組和40%乙醇洗脫部位高、低劑量組小鼠給藥后的痛閾值明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。這提示給藥后消腫止痛液、20%和40%乙醇洗脫部位對熱刺激引起的疼痛具有鎮痛作用。各組小鼠痛閾值測定結果見表4。

表4 各組小鼠痛閾值測定結果（±s，n＝10）Tab 4 Pain threshold of mice in each group（±s，n＝10）

表4 各組小鼠痛閾值測定結果（±s，n＝10）Tab 4 Pain threshold of mice in each group（±s，n＝10）

注：與同組給藥前比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.the same group before administration，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

痛閾提高百分率，%1.59 34.50 23.69 18.89 22.75 10.71 24.78 19.87 27.47 25.94 14.73 8.65組別模型組陽性組消腫止痛液高劑量組消腫止痛液低劑量組水洗脫部位高劑量組水洗脫部位低劑量組20%乙醇洗脫部位高劑量組20%乙醇洗脫部位低劑量組40%乙醇洗脫部位高劑量組40%乙醇洗脫部位低劑量組60%乙醇洗脫部位高劑量組60%乙醇洗脫部位低劑量組給藥前痛閾值，s 15.75±2.86 15.82±2.96 15.74±3.77 16.24±3.43 15.50±3.82 16.15±2.72 16.56±3.97 16.41±4.06 15.89±2.71 16.02±3.67 16.74±3.51 16.56±2.51給藥后痛閾值，s 15.95±3.79 20.86±2.74＊＊##18.65±2.49＊18.80±2.79 18.24±1.73 17.51±2.02 19.32±3.08＊18.93±2.52 20.04±2.79＊＊#19.52±2.47＊#18.33±2.05 17.50±3.80

4 討論

痔瘡是臨床常見多發的肛腸疾病，俗有“十人九痔”之稱。祖國醫學認為，風、濕、熱凝結于肛門，導致氣血壅滯、宿積不散、經絡交錯，終發為痔[14]。寧夏回族自治區地處西北，由于地域特點及風土人情因素，多數居民擅飲酒、喜食牛羊肉及辛辣厚膩之品，故痔瘡發病率較高，達40.06%[15]。我院醫院制劑消腫止痛液在臨床使用中效果良好，將消腫止痛液有效部位開發為軟膏制劑是臨床所需，也是醫院制劑和創新藥物發展的方向[16]。

本課題組采用D101大孔樹脂對消腫止痛液進行有效部位富集，其原因是在前期文獻調研中對該處方中主要藥味黃柏[17]、大黃[18]、五倍子[19]等均有采用D101大孔樹脂進行成分富集的相關研究。馬應龍麝香痔瘡膏具有清熱燥濕、活血消腫、去腐生肌的功效，臨床效果較好，故以其作為本研究的陽性藥[20]。

在進行醋酸致大鼠肛周潰瘍的正式實驗前，筆者先采用貼敷法和肛周注射法進行預實驗，發現貼敷法造模效果不佳，且變異性較大；而肛周注射法造模較為穩定，并對注射劑量進行了篩選，分別用75%冰醋酸以每只0.05 mL和每只0.1 mL的劑量造模，結果按每只0.1 mL劑量造模潰瘍面積過大，而按每只0.05 mL劑量造模潰瘍面積適合，同時應注意注射肛周位置相同，以減少模型間的差異。在制備各部位含藥軟膏時，若藥物不溶于水，先加少量聚山梨酯80助溶，再加蒸餾水溶解作為水相制備軟膏。在制備消腫止痛液給藥組含藥軟膏時，軟膏藥物濃度較大，給藥后不易吸收，在一定程度上影響了療效。

在醋酸致大鼠肛周潰瘍實驗中，痔瘡局部癥狀評分的結果表明，20%、40%和60%乙醇洗脫部位均能改善醋酸致大鼠肛周潰瘍癥狀；觀察痔瘡局部黏膜組織的病理結果表明，40%和60%乙醇洗脫部位能改善醋酸致大鼠肛周潰瘍的病理變化。可見，40%和60%乙醇洗脫部位具有較好的消腫、促潰瘍面愈合作用。在醋酸致小鼠扭體實驗中，20%、40%和60%乙醇洗脫部位均有一定的鎮痛作用。在小鼠熱板實驗中，消腫止痛液、20%和40%乙醇洗脫部位對熱刺激引起的疼痛具有鎮痛作用。根據該研究藥效結果，確定40%乙醇洗脫部位為消腫止痛液有效部位，具有消腫、促潰瘍面愈合、鎮痛的作用。關于高劑量20%乙醇洗脫部位也有一定鎮痛作用，高劑量60%乙醇洗脫部位也有一定的消腫、促潰瘍面愈合作用，可能原因是這兩個部位的化學成分與40%乙醇洗脫部位有一定重疊，尤其是60%乙醇洗脫部位，并且經筆者后期通過超高效液相色譜-質譜（UPLC-MS）技術檢測這3個部位化學成分后，初步得到了驗證。

綜上，本研究首先通過藥效實驗最終確定了40%乙醇洗脫部位為消腫、促潰瘍面愈合和鎮痛的有效部位，后期筆者將繼續對該部位化學成分進行研究，以確定其藥效物質基礎，并將其二次開發為軟膏制劑。