聚偏氟乙烯微孔濾膜-聚多巴胺-氧化石墨烯固相萃取結合離子遷移譜快速檢測尿液中的麻黃堿

柴常偉，劉 迪，崔毅軒，管宇珊，龐 羽，王子晗，蔣 曄

(河北醫科大學 藥學院，河北 石家莊 050017)

隨著經濟的發展，機動車給人帶來方便的同時，交通事故也給駕駛人及路人造成不可逆傷害[1]。目前，因飲酒、非法藥物使用及藥物濫用后駕車已成為交通事故的主要原因[2-6]。藥駕(Driving under the inference of drugs,DUID)[7-8]指在藥物的影響下駕駛，易誘發交通事故。影響駕駛能力的藥物根據標準有不同的分類結果[9-11]。依據藥效作用分類，主要包括毒品類、中樞神經系統興奮劑、中樞神經系統抑制藥、三環類抗抑郁藥物、抗糖尿病藥物、抗高血壓藥物、抗組胺藥等[11]。當今，交通管理部門對于禁止酒駕的宣傳及檢查已相對完善，但對于藥駕方面的交通安全宣傳和整治卻迫在眉睫。同時，高空駕駛人員(如飛機駕駛員)的不合理用藥而引起的藥物不良反應也給飛行人員健康和飛行安全帶來危害和隱患[12-14]。為進一步規范駕駛行為并保證交通、飛行安全，建立藥駕在線檢測和現場監察的方法刻不容緩。

麻黃堿(Ephedrine，EPH)作為生物堿類的中樞神經系統興奮劑，通過人體代謝，主要經腎臟以原形從尿液中排泄[15]，具有發汗、平喘、利尿、抗炎、抗過敏、鎮咳、祛痰、解熱、抗菌、抗病毒等藥用功效，被廣泛應用于醫藥領域[16]。然而，由于EPH引發的神經過敏、耳鳴、失眠、血壓升高、頭痛、頭暈、心慌、血糖升高、心前區疼痛、心動過速、心動過緩、心律失常等不良反應[17-19]，會嚴重影響駕駛安全，因此建立尿液中EPH的快速檢測尤為重要。目前，已報道的關于麻黃堿的檢測手段很多[16]，主要包括光譜法、色譜法[20-26]、電泳法[27-29]、聯用技術[22-24,26]等，其中光譜法[16]主要用于制劑中EPH的檢測；色譜法、電泳法、聯用技術廣泛應用于尿液中的EPH檢測，但這些實驗室檢測手段由于儀器體積及分析時間的限制，不適合現場快檢。對于尿液中EPH的前處理方法主要包括液液萃取(Liquid-liquid extraction，LLE)[20-21,25-26,28-29]和固相萃取(Solid phase extraction，SPE)[22-24]。但LLE萃取和溶劑轉換過程需消耗大量時間；SPE需活化、淋洗、洗脫等繁瑣步驟，且吸附不具有特異性。由此可見，已有的前處理方法和檢測手段均不適用于尿液中EPH的現場快速檢測。

氧化石墨烯(GO)是一種由單層碳原子構成的呈蜂窩狀的二維平面薄膜，主要由碳原子和極性含氧官能團組成，位于表面的羥基和環氧基，以及處于邊緣的羧基使其具有極強的親水性[30]。GO作為一種新型吸附劑，被廣泛應用于固相萃取[31-34]。便攜式高分辨離子遷移譜(Portable high resolution ion mobility spectrometry,PHR-IMS)作為一種大氣壓下對帶電物質進行分離的檢測技術，具有靈敏度高、分析速度快、體積小、便攜等優點，因此廣泛應用于爆炸物的檢測。隨著離子遷移譜(IMS)的發展，其在藥物分析方面的應用嶄露頭角[35-37]。基于此，本文首次采用聚偏氟乙烯微孔濾膜(PVDF)為支撐載體，GO為萃取劑，聚多巴胺為交聯劑，交聯GO與PVDF，建立了聚偏氟乙烯微孔濾膜-聚多巴胺-氧化石墨烯固相萃取(Polyvinylidene fluoride microporous membrane-polydopamine-graphene oxide solid phase extraction,PVDF-PD-GO-SPE)結合PHR-IMS快速檢測尿液中EPH的分析方法，PVDF膜幾分鐘即可完成吸附過程，相比于攪拌棒[33]，顯著節省了吸附時間，可為藥駕在線檢測和現場監察提供有效手段。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Excellims GA2100高效離子遷移譜儀，電噴霧離子源，進樣方式為直接進樣。VisIon Analysis分析軟件(Analysis_2_3_1_23)；Sartorius BP 211D(十萬分之一，上海耀壯檢測儀器設備有限公司)電子天平；Milli-Q 50超純水系統；T1901 雙光束紫外可見分光光度計(北京譜析通用儀器有限公司)；FTIR-8400S 紅外光譜儀(日本島津公司)；S-3500掃描電子顯微鏡(日本日立公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌水浴鍋(鞏義市科華儀器設備有限公司)。

聚偏氟乙烯微孔濾膜(F型)(上海興亞凈化材料廠，規格Φ50 mm)；甲醇(色譜純，Fisher公司)；鹽酸麻黃堿(純度>98%，中國藥品生物制品檢定所，批號:714-8501)；氧化石墨烯為實驗室自制，經紫外光譜、傅立葉紅外光譜、掃描電鏡表征；鹽酸多巴胺(純度>99%，山東西亞化學工業有限公司)；三羥甲基氨基甲烷(Tris試劑純度>99%，天津光復精細化工研究所)；急支糖漿(太極集團重慶涪陵制藥廠有限公司)；所用其它試劑均為分析純。健康受試者尿樣于-20 ℃冰箱中保存。

1.2 溶液的配制

1.2.1 聚多巴胺-Tris-HCl緩沖溶液的制備稱取Tris試劑約0.363 g于300 mL水中溶解，用濃鹽酸調節pH值至8.5，得10 mmol/L的Tris-HCl溶液；稱取約0.6 g的鹽酸多巴胺于10 mmol/L的Tris-HCl溶液中溶解，超聲攪拌至溶液呈棕黑色，即得2 mg/L的聚多巴胺-Tris-HCl緩沖溶液。

1.2.2 鹽酸麻黃堿對照品的制備精確稱取鹽酸麻黃堿對照品25.82 mg于25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制得質量濃度為1.033 mg/mL的鹽酸麻黃堿甲醇對照品儲備溶液。取甲醇儲備液制備1.033 μg/mL的麻黃堿甲醇溶液。

精確稱取鹽酸麻黃堿對照品12.37 mg于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，得質量濃度為123.7 μg/mL的鹽酸麻黃堿水溶液儲備液。

1.2.3 加標樣品溶液的制備取近期未服用含有麻黃堿藥品的健康成年人尿液作為空白樣品進行測定。分別取123.7 μg/mL的鹽酸麻黃堿水溶液儲備液0.25、1.0、5.0 mL于100 mL容量瓶中，用空白尿樣進行稀釋，得0.309、1.237、6.185 μg/mL 3個質量濃度水平的加標樣品溶液。

1.3 PVDF-PD-GO-SPE的制備

參考文獻[33-34]制備氧化石墨烯，并采用紫外光譜、傅立葉紅外光譜、掃描電鏡表征，結果與文獻報道一致。取20 mg氧化石墨烯超聲分散于20 mL水中，即得1 mg/mL氧化石墨烯溶液，于4 ℃保存備用。首先將聚偏氟乙烯微孔濾膜用甲醇清洗，干燥。然后將干燥好的濾膜放入聚多巴胺-Tris-HCl緩沖溶液中，于30 ℃水浴中攪拌12 h。待反應完成后，將濾膜干燥，即得聚多巴胺涂層的濾膜。然后將其放入氧化石墨烯溶液(1 mg/mL)中，于65 ℃水浴中反應10 h后取出，干燥。重復以上步驟2次，即得具有一定厚度的氧化石墨烯鍍層濾膜(PVDF-PD-GO-SPE)。再將該膜用甲醇超聲清洗10 min，干燥，待用。

1.4 樣品前處理

吸附過程：將萃取膜卷成管狀置于10 mL離心管中，加入加標尿樣溶液10 mL，渦旋吸附5 min，棄去樣品溶液；去基質過程：用5 mL超純水清洗萃取膜及離心管，棄去洗滌水，重復3次；洗脫過程：加入甲醇1 mL，渦旋洗脫10 min，洗脫液待測。操作流程見圖1。

圖1 樣品處理過程示意圖Fig.1 Schematic of the experimentation

1.5 IMS分析

進樣前，取校正溶液對儀器進行校正，校正完成后，取樣品溶液30～40 μL，進行IMS分析。IMS工作模式為正離子模式，源電壓2 800 V，遷移管電壓8 400 V，氣體進樣溫度170 ℃，遷移管溫度170 ℃，門電壓寬度120 μs，門電壓50 V，譜圖時長26 ms；溶劑延遲0 ms，譜圖疊加10次，采集運行時長10 s，采集速率200 K Samples/Sec；排氣泵速率1.25 L·min-1，遷移氣速率1.00 L·min-1；直接噴霧進樣流速1.0 μL·min-1，進樣針直徑1.46 mm。

2 結果與討論

2.1 IMS操作參數優化

為提高EPH在離子遷移譜上的響應強度，從而進一步提高檢測靈敏度，實驗取1.033 μg/mL麻黃堿甲醇溶液進樣，對離子遷移譜的主要檢測參數如遷移管電壓(7 500～8 500 V)、遷移管溫度(140～180 ℃)、門電壓(40～90 V)、門寬度(80～130 μs)進行了優化，優化范圍上限依據儀器所允許的最大值界定。

遷移管電壓和遷移管溫度是影響待測物響應強度及分辨率的重要參數，因此實驗考察了遷移管電壓和遷移管溫度對響應強度及遷移時間的影響。結果顯示，遷移時間與遷移管電壓呈現負相關(r2=0.998)；響應強度在7 500～8 400 V范圍內與遷移管電壓呈正相關(r2=0.991)，且在8 400V時響應強度最大，因此遷移管電壓以最優值8 400 V為儀器使用條件。在優化范圍內，遷移管溫度與遷移時間呈現負相關(r2=0.980)；而遷移管溫度與響應強度無相關性，但在170 ℃時的響應強度最大。遷移管電壓與溫度對遷移時間負相關的依賴性，表明帶電離子在遷移管內的遷移行為的改變不可忽略。

離子化物質具有一定的能量才能克服門電壓的限制進入遷移管，同時門電壓限制了其他弱電物質進入遷移管，增大待測物的響應強度，但若門電壓過高，待測物能量過低則進入遷移管的量降低，降低了待測物響應強度，通過實驗優化，發現門電壓為50 V是最適條件。另外，門寬度越大，進入遷移管的待測物響應越高，但同時基線波動越大，靈敏度越低，因此選擇門寬度為120 μs。

2.2 PVDF-PD-GO-SPE鍍膜次數的優化

考察了聚多巴胺-氧化石墨烯鍍膜次數(0、1、2、3次)對PVDF-PD-GO-SPE吸附性能的影響(圖2)，結果顯示，未鍍膜的空白PVDF膜(曲線E)對EPH有少量吸附，吸附率為1.6%，而鍍膜之后(曲線B、C、D)的PVDF-PD-GO-SPE對EPH萃取效率顯著提高，因此空白膜的少量吸附可以忽略，且鍍膜2次(曲線C)與3次(曲線B)的萃取效率無明顯差異，為了節約時間成本，本研究選擇PVDF-PD-GO-SPE鍍膜2次。

圖2 PVDF-PD-GO-SPE鍍膜次數的優化Fig.2 The optimization of coating times on PVDF-PD-GO-SPEA.ephedrine control peak，B.coating three times，C.coating two times，D.coating one time，E.blank film

2.3 萃取過程的優化

2.3.1 樣品溶液及洗脫溶劑體積的優化實驗考察了吸附過程中，樣品溶液體積(2、5、10 mL)對EPH響應強度的影響。結果顯示，當樣品溶液體積為2、5 mL時，渦旋順利進行，響應強度為0.541～0.607 V；當樣品溶液體積為10 mL時，樣品溶液處于震蕩狀態，渦旋操作受限，響應強度為0.781～0.868 V。推測該現象的可能原因為：吸附過程是一個動態結合-解吸過程，當渦旋順利進行時，渦旋作用力較大，待測組分與氧化石墨烯之間的吸附力不足以克服渦旋作用力，造成已吸附的待測物又回到溶液中；當離心管中加入的樣品溶液過多時，若再進行渦旋操作，操作受阻，已吸附的待測物可以相對穩定地吸附于萃取膜上，而渦旋提供的震蕩作用力足以減小吸附劑附近的濃差極化，使得吸附過程順利進行。因此選擇樣品溶液體積為10 mL。

考察洗脫過程中解吸溶液體積(1、2、5 mL)對EPH響應強度的影響，結果發現洗脫溶液體積為1 mL時，響應強度最大，因此選擇洗脫劑體積為1 mL。

2.3.2 吸附過程、洗脫過程時間的優化實驗分別考察了吸附時間(2、5、8、10 min)和洗脫時間(2、5、8、10、12 min)對結果的影響。發現當吸附5 min，洗脫10 min時，響應強度最高，因此選擇吸附時間5 min、洗脫時間10 min為實驗最優條件。

2.3.3 PVDF-PD-GO-SPE使用次數取“1.2.2”制備的EPH儲備溶液配成1.237 μg/mL質量濃度的溶液，在優化條件下測定，記錄IMS圖譜，然后使用甲醇和水各洗滌2次，重復操作。結果顯示，該PVDF-PD-GO-SPE至少可以重復使用14次，第14次測定之后的萃取效率為初始值的96.9%～102%，其萃取效率無明顯變化，說明該鍍層在萃取過程中具有良好的耐受性和穩定性。

圖3 專屬性考察Fig.3 The results of specificity testA:blank urine sample,B:1.033 μg/mL standard solution,C:spiked 0.309 μg/mL sample solution

2.4 方法學驗證

2.4.1 專屬性空白樣品溶液及0.309 μg/mL加標樣品溶液按照“1.4”方法處理，進樣，采集譜圖信息。如圖3所示，麻黃堿在(9.18±0.013)ms出峰。對比圖3A、B、C可知尿液基質不干擾EPH的測定，分離良好，方法具有較強的專屬性。

2.4.2 線性關系、檢出限與定量下限取空白尿液，準確配制成系列濃度的質控樣品溶液，在優化條件下測定并記錄IMS圖譜，以響應強度(E)對其質量濃度(C)繪制標準曲線。結果顯示，EPH在0.124～6.129 μg/mL質量濃度范圍與響應強度呈良好的線性關系，線性方程為E=0.581C+0.225(r2=0.988)。取最低點質控樣品逐級稀釋，依次進樣分析，以S/N=3和S/N=10時對應的質量濃度分別記為檢出限、定量下限，計算得麻黃堿的檢出限為9.60 ng/mL，定量下限為32.0 ng/mL。

2.4.3 回收率與相對標準偏差取“1.2.3”制備的低(0.309 μg/mL)、中(1.273 μg/mL)、高(6.185 μg/mL) 3個濃度加標樣品各3份，按照“1.4”方法處理后進樣，以IMS中的峰面積計算回收率，得回收率為91.0%～113%，RSD為4.6%～8.5%。

2.4.4 實際樣品檢測健康受試者3人，一次性服用急支糖漿5 mL，服藥后5 h采集尿樣，在優化條件下處理后進樣測定，采集譜圖信息，得麻黃堿的質量濃度分別為1.240(曲線1)、1.052(曲線2)、0.490(曲線3) mg/L，結果見圖4。

圖4 實際樣品檢測譜圖Fig.4 The spectra of real samples

2.5 與已有方法的比較

尿液中EPH的前處理方法主要包括液液萃取和固相萃取(表1)，但液液萃取需長時間的萃取相平衡過程，且萃取劑與檢測手段不相符的還要進行溶劑轉換，操作繁瑣耗時；傳統的固相萃取要經活化、淋洗、洗脫、溶劑轉換等繁瑣步驟，也不適用于EPH的快速檢測。本文建立的新型PVDF-PD-GO-SPE膜萃取方法，操作簡單省時，氧化石墨烯吸附劑可以特異性吸附EPH，且不需要長時間的吸附過程，無需溶劑轉換，洗脫液可直接測定。

對比可知，PHR-IMS法的檢測靈敏度與色譜-質譜聯用法相當，相較于色譜法可以提高2～3個數量級。PHR-IMS操作簡單、大氣壓下即可操作、體積小便于攜帶、分析測定可在數秒內完成的優點為藥駕的快速現場檢測，提供了可行性，奠定了基礎。

表1 前處理方法比較Table 1 The comparison of pretreatment methods

3 結 論

本文首次以聚偏氟乙烯為支撐載體，通過聚多巴胺結合氧化石墨烯吸附劑制成新型固相萃取模式，增大了吸附表面積，進一步縮短了吸附時間、洗脫時間，操作簡單、省時；將其與PHR-IMS結合可實現尿液中麻黃堿的快速檢測，該方法操作簡單、靈敏度高、重現性好，為藥駕在線檢測和現場監察提供了一種有效手段。