硅烷功能化碳點熒光探針檢測槲皮素

杜青青，張平平，談 瓊，陳月丹

(1.齊魯醫藥學院 藥學院，山東 淄博 255300；2.山東省高校生物醫學工程技術重點實驗室，山東 淄博 255300)

槲皮素(Quercetin)是最常見的一種生物活性的類黃酮化合物，廣泛存在于水果、蔬菜、茶葉和中草藥中。槲皮素具有祛痰、降血壓血脂、保護心血管等作用，可用于慢性支氣管炎、高血壓和冠心病患者的臨床輔助治療。研究發現，槲皮素還具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗腫瘤等活性[1]。由于其廣泛的藥理活性，其常被作為各類中藥材的有效成分進行質量控制。因此，探索槲皮素的含量測定方法具有重要意義。目前槲皮素含量檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[2]、毛細管電泳法(CE)[3]、電化學法(DPSV)[4]、熒光光度法(FS)[5-6]等。其中，基于納米探針的熒光分析法具有簡便、快速、成本低等優點，引起了研究人員的廣泛關注，而傳統的半導體量子點探針易對生物和環境造成有害影響[7]，因此，有必要開發環境友好的熒光材料并建立一種簡單、高效、靈敏檢測槲皮素的分析方法。

2006年，孫亞平等[8]通過激光燒蝕碳靶，經硝酸氧化和聚乙二醇鈍化后，獲得熒光納米顆粒，并首次定義為碳點。碳點粒徑一般小于10 nm，是繼碳納米管、石墨烯和納米金剛石后出現的一種新型碳納米功能材料[9]。相較于有機染料和傳統的半導體量子點，碳點不僅保持了碳基材料無毒、生物相容性好等優勢，還具有水溶性優異、光穩定性好、易于功能化、價廉易得等特性[10]，在分析檢測[11-12]、生物成像[13-14]、藥物遞送[15]等眾多領域均表現出發展潛力。設計得到熒光效率高、功能基團豐富的碳點可為槲皮素檢測提供新思路。劉春艷[16]課題組最先利用熱解法制備了量子產率47%的硅烷(AEAPMS)功能化碳點，通過包覆二氧化硅可將該非水溶性硅烷碳點轉變為水溶性納米材料，用于細胞成像。該課題組[17]進一步研究硅烷碳點自聚及與有機硅烷共聚，獲得了具有光限幅性能的透明熒光凝膠玻璃。研究表明，硅烷碳點可用作檢測探針。Chen等[18]分別將多種有機硅烷與水混合，300 ℃水熱反應得到硅烷碳點，熒光效率可達42.6%，并成功用于溫度探針。Zou等[19]根據劉春艷課題組報道的熱解法合成硅烷碳點，研究了pH值、溫度、干擾物的影響，首次實現了槲皮素的高靈敏、選擇性檢測，檢出限為79 nmol/L。Song等[20]合成了硅烷碳點印跡熒光納米顆粒，用于玉米中玉米烯酮的檢測，檢出限為0.02 mg/ L。

本課題組前期以檸檬酸為碳源，硅烷偶聯劑KH792為表面包覆劑，一步水熱法制備了硅烷功能化碳點[21]。相較于熱解法，所得碳點具有熒光效率高(高達69.2%)、表面功能基團豐富、水溶性好的優勢，更有利于水溶液中槲皮素的檢測和靈敏度的提高。本工作研究了水熱硅烷碳點與槲皮素的相互作用，基于槲皮素對該碳點的熒光猝滅作用，建立了一種碳點納米熒光探針高靈敏檢測槲皮素的新方法，檢出限低至3.8 nmol/L，并進行了自來水中槲皮素的加標回收實驗，相比于文獻進一步提高了方法的靈敏度和實用性。同時，初步探討了槲皮素對該硅烷碳點的熒光猝滅機制。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

JEM-2100F型透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)；IR-21型傅立葉紅外光譜儀，UV-2250紫外-可見分光光度計(日本島津儀器公司)；F-380型熒光分光光度計(港東科技有限公司)；酸度計(梅特勒-托利多有限公司)。

硅烷偶聯劑KH792(東莞市山一塑化有限公司)；槲皮素(中國藥品生物制品檢定所)；檸檬酸、磷酸、硼酸、冰醋酸、氫氧化鈉(國藥集團化學試劑有限公司)；實驗用水均為超純水。

槲皮素標準溶液：準確稱取0.006 g槲皮素，加入10.0 mL無水乙醇溶解后，轉移至50 mL容量瓶中定容至刻度，得到400.0 μmol/L的槲皮素溶液，4 ℃保存待用，使用時逐級稀釋;pH 7.0伯瑞坦-羅賓森(BR)緩沖溶液。

1.2 實驗方法

1.2.1 碳點的合成碳點制備采用本課題組前期報道的合成方法[21]：稱取0.5 g檸檬酸，加入10.0 mL水及10.0 mL硅烷偶聯劑KH792，待混合均勻后，將所得溶液轉移至反應釜中，電熱鼓風干燥箱180 ℃反應12 h，反應結束自然冷卻至室溫，得到澄清黃棕色液體。利用正已烷萃取3次，得最終碳點流體產物。前期研究發現高濃度碳點出現濃度猝滅效應[20]，將所得產物用水稀釋400倍后待用。

1.2.2 碳點熒光猝滅檢測槲皮素在10 mL比色管中依次加入1.0 mL BR緩沖溶液、1.0 mL SiCDs溶液及不同量槲皮素溶液，用水稀釋至刻度并搖勻，靜置20 min，設定熒光分光光度計參數λex=360 nm，測定體系450 nm處發射峰的熒光強度，計算熒光強度變化ΔF=F0-F。(F0和F分別表示加入槲皮素前后體系的熒光強度)。

圖1 SiCDs的透射電鏡圖Fig.1 TEM image of SiCDs

圖2 SiCDs的紅外光譜Fig.2 FTIR spectrum of SiCDs

圖3 SiCDs的紫外吸收及熒光光譜Fig.3 UV-Vis absorption spectrum and fluorescence emission spectrum of SiCDs

2 結果與討論

2.1 SiCDs的表征

圖4 pH值對作用體系熒光強度的影響Fig.4 Effect of pH value on fluorescence intensity of the system

2.2 槲皮素與SiCDs作用條件的優化

2.2.1 pH值的優化考察了pH值對SiCDs-槲皮素體系熒光強度的影響。如圖4所示，在pH 4.0～7.0時，SiCDs自身熒光隨pH值的增大而增強，之后趨于穩定。當體系pH 7.0時，ΔF較大，信噪比高，SiCDs與槲皮素在此條件下相互作用較強，且該pH值與生理條件接近，故實驗選擇pH 7.0為緩沖溶液的最佳pH 值。

2.2.2 槲皮素與SiCDs作用時間的選擇考察了pH 7.0時，體系熒光強度隨作用時間的變化。實驗發現，加入槲皮素5 min后，SiCDs熒光強度降低，20 min后趨于穩定，因此實驗選擇最佳作用時間為20 min。

圖5 不同濃度槲皮素存在下SiCDs的熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of SiCDs upon addition of different quercetin concentrationsquercetin concentration(a-n):0,1.0,2.0,4.0,5.0,6.0,8.0,10.0,15.0,20.0,25.0,30.0,35.0,40.0 μmol/L;insert:relationship between fluorescence quenching and quercetin concentration

2.2.3 SiCDs用量的選擇考察了SiCDs的不同加入量(0.01、0.1、1.0 mL)對SiCDs-槲皮素體系的影響。結果顯示，體系中加入1.0 mL SiCDs時，體系的響應靈敏度最高，因此實驗選擇SiCDs的最佳用量為1.0 mL。

2.3 槲皮素對SiCDs的熒光響應

2.3.1 標準曲線與檢出限在上述優化條件下，研究了槲皮素對SiCDs熒光光譜的影響，并建立了SiCDs熒光強度變化與槲皮素濃度的線性響應關系，結果如圖5所示。由圖5可見，槲皮素對碳點具有熒光猝滅作用，且隨著槲皮素濃度的增大，SiCDs的熒光強度逐漸降低。當槲皮素濃度在1.0～40.0 μmol/L時，SiCDs的熒光猝滅值與槲皮素濃度呈良好線性關系(內插圖)，線性方程為ΔF=34.418C+24.732(ΔF=F0-F，C為槲皮素的濃度，單位為μmol/L)，相關系數r=0.996 7。該方法的檢出限(3.3δ/K)為3.8 nmol/L。對25.0 μmol/L槲皮素與SiCDs作用體系進行6次平行測定，所得熒光強度的相對標準偏差(RSD)為1.8%。說明該方法具有較高的靈敏度和精密度，可滿足微量分析的要求。

2.3.2 干擾實驗考察了常見陽離子和常用輔料淀粉的存在對體系測定槲皮素的影響。實驗結果顯示，在槲皮素濃度為10.0 μmol/L時，可允許共存10倍濃度的淀粉，50倍濃度的Na+，100倍濃度的Ca2+、Zn2+、Mg2+、K+、Al3+，表明該方法具有較好的選擇性。

2.3.3 實際樣品的分析為了進一步考察所建立方法的實用性，將該方法用于自來水中槲皮素的測定，并考察了3種不同加標濃度(5.0、10.0、20.0 μmol/L)的回收實驗，測得方法的加標回收率為91.5%～92.0%，相對標準偏差(RSD)為0.30%。測定結果表明該方法的RSD和加標回收率均在可以接受的范圍內，可用于實際樣品的分析。

2.3.4 不同槲皮素檢測方法的比較將本方法與文獻報道用于檢測槲皮素的方法進行比較，結果如表1所示。本方法具有較寬的線性范圍和很高的檢測靈敏度。

表1 不同槲皮素檢測方法的比較Table 1 Comparison of different methods for determination of quercetin

2.4 熒光猝滅機制

為了研究槲皮素對SiCDs的熒光猝滅機制，本實驗考察了作用前后紫外吸收光譜的變化。如圖6所示，SiCDs在240 nm和360 nm處存在2個特征吸收峰，槲皮素在380 nm處存在特征吸收峰。二者相互作用后，在320 nm左右出現了新的吸收峰，該吸收峰既非SiCDs吸收峰，也不歸屬于槲皮素吸收峰。分析二者的結構、紫外光譜和碳點紅外光譜可知，由于溶劑水的存在，SiCDs在形成過程中除了檸檬酸的羧基與硅烷氨基發生酰胺化反應外，硅烷部分水解，使SiCDs表面修飾了以—NH2為端基的長鏈基團。由于槲皮素屬于弱酸，含有豐富的酚羥基，二者通過靜電作用，形成了新的共軛結構，從而導致了吸收光譜的變化和SiCDs的熒光猝滅。而—NH2的存在有利于增強相互作用，進而顯著提高了檢測靈敏度。根據實驗結果初步判斷作用機制屬于靜態猝滅。

為進一步確證猝滅機制，研究了不同溫度下槲皮素對SiCDs的熒光猝滅作用。依據Stern-Volmer方程F0/F=1+KSVC處理數據，F0和F分別為碳點與槲皮素作用前后的熒光強度，KSV為猝滅常數，C為槲皮素濃度。圖7為分別在25 ℃和45 ℃條件下所得SiCDs熒光強度與槲皮素濃度的關系曲線，均呈現良好的線性關系，相關系數r分別為0.996 9和0.992 0，猝滅常數分別為0.017 8和0.016 1，說明本實驗體系只存在1種猝滅方式，且當溫度升高時，猝滅常數減小。綜上，判斷槲皮素對SiCDs的猝滅機制主要為靜態猝滅。

圖6 SiCDs、槲皮素、碳點-槲皮素的紫外吸收光譜Fig.6 UV-Vis absorption spectra of SiCDs,quercetin and SiCDs-quercetin solution

圖7 不同溫度下槲皮素對SiCDs的猝滅效應Fig.7 Quenching effect of quercetin on SiCDs at different temperatures

3 結 論

本文合成了具有豐富表面基團的水溶性SiCDs，并以SiCDs為熒光探針建立了槲皮素的熒光分析方法，基于作用體系結構和作用效應分析，闡釋了熒光猝滅機制為槲皮素酚羥基與SiCDs表面堿性基團靜電作用導致靜態猝滅。在優化實驗條件下，槲皮素濃度在1.0～40.0 μmol/L范圍內與SiCDs熒光強度呈良好線性關系。該方法操作簡便、靈敏度高，檢出限低至3.8 nmol/L，可用于實際樣品的檢測。