流動注射-化學發光法測定豬飼料中的吡喹酮

羅 瓊，陳復彬，李青輕，黎 東，楊春艷*

(1.西華師范大學 化學化工學院 化學合成與污染控制四川省重點實驗室，四川 南充 637002；2.南充市食品藥品檢驗所，四川 南充 637000)

吡喹酮(Praziquantel)是一種合成的異喹啉—吡嗪衍生物，世界衛生組織(WHO)將其歸納為一種基本藥物[1]，在治療由血吸蟲病引發的發育遲緩、消瘦、缺乏體能、認知障礙及不孕等疾病中發揮著重要作用[2]；與此同時，它還是治療家畜中由各種吸蟲和絳蟲引發感染的重要藥物[3]。然而，在實際應用中，吡喹酮卻因其高效和廉價的特點而被過度濫用，產生了嚴重的藥物殘留，殘留量甚至超過了“日本肯定列表制度”中對其規定的 20 μg/kg 的范圍[4]，給人們的健康帶來了很大危害(如：萎靡不振、頭痛、惡心、腹痛、產生耐藥性等癥狀)[5]。盡管中國尚未對吡喹酮殘留量做出明確的規定，但作為一個貿易大國，對吡喹酮殘留量的檢測是不可或缺的。目前檢測吡喹酮的方法主要有：液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[6-9]、氣相色譜法(GC)[10]、中紅外光譜法[11]、反相高效液相色譜-紫外法(RP-HPLC-UV)[12]等。盡管這些方法對吡喹酮的檢測有一定優勢，但往往需要昂貴的儀器，且檢測時間長、操作復雜，因此尋找一種儀器便宜，并能簡單、快速檢測吡喹酮的方法至關重要。而流動注射-化學發光法(FI-CL)可滿足以上優點，此外其還有很高的檢測靈敏度，在醫藥[13-15]、環境[16-17]、食品[18-19]等各個領域均具有廣泛的應用。

本研究發現，Luminol與NaIO4能產生化學發光，而吡喹酮可使其化學發光強度顯著降低，且發光強度與吡喹酮濃度在一定范圍內呈線性關系，基于此建立了測定吡喹酮的新方法,并成功運用于豬飼料中吡喹酮含量的測定，結果令人滿意。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

RFL-1型超微弱化學發光/生物發光檢測儀(西安瑞邁分析儀器有限公司)，UV-2550型紫外可見分光光度計(日本島津公司)，Cary Eclipse熒光分光光度計(安捷倫公司)。

Luminol儲備液(1.0×10-2mol/L)：稱取0.177 2 g Luminol，用0.1 mol/L NaOH溶液溶解后轉入100 mL棕色容量瓶中，用水定容，避光保存，使用前至少放置24 h，使用時逐級稀釋；吡喹酮儲備液(1.0×10-3mol/L)：稱取0.015 6 g吡喹酮用水溶解并定容后，避光保存，使用時逐級稀釋；1.0×10-2mol/L的NaIO4儲備液；實驗所用試劑均為分析純；實驗用水均為超純水。

1.2 實驗方法

FI-CL流路如圖1所示：蠕動泵P1分別輸送Luminol與NaOH溶液，當流動體系平穩，化學發光信號穩定時，獲得基線信號Io。吡喹酮和NaIO4溶液以及載流H2O通過蠕動泵P2輸送，且吡喹酮溶液及載流H2O通過六通閥V進樣，反應產生的抑制信號為Is。分別記錄發光體系的基線信號(Io)和抑制信號(Is)，峰高值ΔI=Io-Is。

圖2 魯米諾化學反應的化學發光動力學曲線Fig.2 Chemiluminescence kinetic curve of luminol chemical reactionc(Luminol)=4.0×10-4 mol/L;c(NaIO4)=3.0×10-4 mol/L;c(NaOH)=8.0×10-3 mol/L;c(Praziquantel)=2.0×10-7 mol/L

2 結果與討論

2.1 化學發光動力學曲線及機理的探究

吡喹酮對Luminol-NaIO4發光體系的發光信號具有很強的抑制作用，其化學發光動力學曲線如圖2。由圖可以看出，未加入吡喹酮時，反應產生較強的化學發光。該化學發光反應的速度很快，化學發光信號在反應開始后1.9 s達到峰值，發光強度為5 329；當加入吡喹酮后，發光強度被抑制，化學發光信號反應開始后2.3 s達到峰值，發光強度為1 908。因此，無論吡喹酮是否加入Luminol-NaIO4化學發光體系中，從化學反應開始至達到峰值的時間均很短，這表明該體系是一種快速發光反應，適合于用FI-CL方法檢測吡喹酮。

為了考察Luminol-NaIO4-Praziquantel可能的反應機理，進行了如下實驗：將熒光分光光度計的光源關掉，借助流動注射技術分別掃描了Luminol-NaIO4以及含有吡喹酮的Luminol-NaIO4混合溶液的化學發光光譜(圖3)。結果表明：Luminol-NaIO4-Praziquantel與Luminol-NaIO4的最大發射波長均在425 nm左右，與文獻報道的Luminol氧化產物—3-氨基鄰苯二甲酸根離子(3-APA*)的最大發射波長類似[20]，這表明無論吡喹酮是否參與反應，該體系的發光體始終為激發態的3-APA*。

為進一步探討吡喹酮對Luminol-NaIO4體系抑制作用的反應機理，本研究采用紫外-可見分光光度計分別測定了溶液不同混合方式的紫外吸收光譜(圖4)。如圖所示，Luminol與NaIO4混合溶液的吸收光譜(曲線d)并不是由Luminol(曲線b)與NaIO4(曲線a)的吸收光譜純粹疊加所形成。Luminol在221、300、347 nm處的吸收峰值降低，NaIO4在194 nm處的吸收峰值消失，說明Luminol與NaIO4發生了反應。當向Luminol-NaIO4體系加入吡喹酮溶液時，對比曲線d和g，兩者吸收峰的位置大致相似，而吡喹酮在201 nm處的吸收峰消失(曲線c)，NaIO4在194 nm處(曲線a)的吸收峰消失，Luminol的特征吸收峰略有降低，說明吡喹酮與體系中的NaIO4發生了反應，導致其吸收光譜的峰形發生了變化。

圖3 魯米諾化學反應的化學發光光譜Fig.3 Chemiluminescence spectra of luminol chemical reactionsc(Luminol)=5.0×10-3 mol/L;c(NaIO4)=3.0×10-4 mol/L;c(Praziquantel)=1.0×10-4 mol/L;c(NaOH)=0.1 mol/L

圖4 不同溶液的紫外-可見吸收光譜Fig.4 Ultraviolet-Visible absorption spectra of different solutionsc(Luminol)=5.0×10-3 mol/L;c(NaIO4)=3.0×10-4 mol/L;c(Praziquantel)=1.0×10-4 mol/L;c(NaOH)=0.1 mol/L

2.2 實驗條件的選擇

2.2.1 流路及儀器參數的選擇為了獲得最佳的化學發光強度，對不同流路、混合管長度(3～9 cm)以及光電倍增管負高壓(500～700 V)進行考察。實驗發現：當采用圖1的流路，且混合管長度為7 cm，光電倍增管負高壓為550 V時，化學發光強度較大且信號穩定。

2.2.2 流速的選擇試劑的流速會對化學發光強度造成一定影響，因此本實驗對P1泵(1.4～3.0 mL/min)與P2泵(1.3～3.0 mL/min)的流速進行了考察。結果顯示，當P1泵的流速在1.4～1.9 mL/min范圍時，發光強度隨著流速的增加而增加；而當流速大于1.9 mL/min時，發光強度反而下降。實驗表明：Luminol與NaOH混合溶液的進樣速率會直接影響發光強度的大小，且當P1泵的流速為1.9 mL/min時發光強度達到最佳。因此，選擇1.9 mL/min作為P1泵的最佳流速。同理分析可知，當P2泵的流速在1.3～2.4 mL/min范圍時，發光強度隨流速的增加而增加；當流速大于2.4 mL/min時，發光強度反而下降。因此，選擇2.4 mL/min作為P2泵的最佳流速。

2.2.3 化學發光試劑的優化對該體系中所有試劑(NaOH、Luminol及NaIO4)的濃度進行優化。由于介質的堿性強弱對該體系具有重要影響，且不同的堿性介質對發光強度的作用也不同。實驗配制了相同濃度的NaOH、Na2CO3和NaHCO3等堿性溶液，分別以此3種溶液作為該體系的堿性介質。結果表明，在以NaOH為堿性介質時，吡喹酮的化學發光強度相對穩定且檢測信號好。因此，實驗選用NaOH作為檢測體系的堿性介質。進一步考察不同濃度NaOH(1.0×10-4～2.0×10-2mol/L)對體系的影響。結果顯示，初始階段，體系的化學發光信號隨著NaOH濃度的增加而增加，當濃度為8.0×10-3mol/L時化學發光強度達到最高，隨著NaOH濃度的繼續增大，化學發光強度反而減小，因此實驗選擇8.0×10-3mol/L作為NaOH的最佳濃度。

Luminol作為化學發光反應中的發光劑，其濃度變化也對該體系的發光強度、檢測靈敏度以及線性變化產生直接影響。本實驗考察了Luminol在1.0×10-5～1.0×10-3mol/L濃度范圍內的影響。結果顯示，化學發光強度隨Luminol濃度的增加而增加，當其達到4.0×10-4mol/L后，化學發光信號的強度逐漸趨于平穩，從試劑的節約性考慮，選擇Luminol溶液的最佳濃度為4.0×10-4mol/L。

NaIO4作為該實驗體系的氧化劑，其濃度同樣影響著發光強度。本實驗對NaIO4在1.0×10-5～1.0×10-3mol/L濃度范圍內進行了考察。結果顯示，體系的化學發光信號隨著NaIO4濃度的增大而增大，當濃度為3.0×10-4mol/L時化學發光強度達到最大，隨著其濃度的繼續增大，化學發光強度的增加逐漸減緩，因此實驗選擇NaIO4的最佳濃度為3.0×10-4mol/L。

圖5 不同濃度吡喹酮在Luminol-NaIO4體系的流動注射信號Fig.5 Typical flow injection signals for different concentrations of praziquantel in the Luminol-NaIO4 systeminset:linear calibration curve in different praziquantel concentrations

2.3 線性范圍、檢出限與精密度

在最佳條件下，考察了不同濃度吡喹酮與相對化學發光強度(ΔI)的線性關系。結果顯示，吡喹酮濃度在4.0×10-8～1.0×10-6mol/L范圍內與ΔI呈良好線性關系，且不同濃度的吡喹酮在Luminol-NaIO4體系中隨時間的遞增呈逐漸遞減的規律性變化(圖5)。吡喹酮的檢出限(3σ)為9.9×10-9mol/L，其線性方程為：ΔI=96.48c+84.38(c的單位為10-7mol/L)，r2=0.991 1。對2.0×10-7mol/L的吡喹酮溶液平行測定11次，相對標準偏差(RSD)為1.4%。

將本方法與文獻報道檢測吡喹酮的方法進行比較，由表1可知，與其它方法相比，此方法具有使用儀器簡單、檢測靈敏度高的優點。

表1 不同方法測定吡喹酮的比較Table 1 Comparison of different methods for determination of praziquantel

* no data

2.4 干擾實驗

2.5 樣品的測定

所測豬飼料樣品均購自周邊農貿市場的，對購買的豬飼料進行前處理[23]，然后按照“1.2”方法，將其稀釋至線性范圍內進行加標回收實驗以檢驗該方法的準確性(表2)。結果顯示：按不同濃度進行加標后，測得豬飼料中吡喹酮的加標回收率為98.5%～100%，RSD為1.6%～2.4%。

表2 豬飼料中吡喹酮含量的測定結果(n=7)Table 2 Determination results of praziquantel in pig feed(n=7)

*no data

3 結 論

本文基于吡喹酮對Luminol-NaIO4化學發光體系較強的抑制作用，聯合流動注射技術，建立了一種簡單、快速、靈敏測定吡喹酮的新方法。該方法的檢測范圍為4.0×10-8～1.0×10-6mol/L，檢出限為9.9×10-9mol/L，加標回收率為98.5%～100%。該方法靈敏度高、分析速度快，可用于豬飼料中吡喹酮含量的測定。