小桐子低溫脅迫下microRNA實時熒光定量PCR內參的篩選與比較

孔春艷 陳永坤 王莎莎 郝大海 楊宇 龔明

（云南師范大學生命科學學院 生物能源持續開發利用教育部工程研究中心 云南省生物質能與環境生物技術重點實驗室，昆明 650500）

microRNA（miRNA）是一類大小為20-24 nt、具有調控功能的內源性非編碼RNA。眾多的miRNA參與了植物對低溫的感受、響應、信號轉導和適應過程［1-2］。在miRNA研究中，通常需要對miRNA在植物各組織和器官中的表達量進行分析，確定miRNA表達量對于探究miRNA的生物學功能尤其重要［3-4］。實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技術具有高靈敏性、特異性、快速簡單、低樣本濃度需求等優點，是研究基因表達的首選方法［1-2，5］。然而，qRT-PCR結果中基因表達量的精確和準確性分析依賴于所選擇的內參基因［6］。在qRT-PCR中，最常用的植物內參基因包括肌動蛋白（ACT）、甘油醛3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、18S核糖體RNA（18S）和F-BOX家族蛋白（FP），但在miRNA定量檢測中并不選擇這些內參基因［7-8］。研究表明當選用ACT作為miRNA研究的內參時，由于目的miRNA與ACT的大小有較大的差異，在校正miRNA數據時并不理想［9］。不經篩選直接使用常見內參基因會降低試驗結果的準確性［10-12］。內參基因的穩定性差導致基因表達量檢測的誤差，如在研究雜交蘭（Cymbidium hybrid）花器官不同部位中八氫番茄紅素脫氫酶基因（ChPDS）的表達模式時，以雜交蘭泛素蛋白基因（ChUBQ）、雜交蘭延伸因子基因（ChEF-1α）、雜交蘭微管蛋白基因（ChTUB）、雜交蘭肌動蛋白基因（ChACT）及雜交蘭泛素蛋白基因（ChUBQ）和雜交蘭延伸因子基因（ChEF-1α）組合進行校正的雜交蘭ChPDS表達模式均為花瓣＞唇瓣＞蕊柱，而以穩定性最差的雜交蘭RNA聚合酶β亞基基因（ChrpoB）進行校正時，雜交蘭ChPDS相對表達量為花瓣＞蕊柱＞唇瓣［13］。因此，針對實際情況篩選內參基因很有必要性［1-2，5］。

小桐子（Jatropha curcas）是一種有巨大綜合開發潛力的多用途能源植物樹種，原產熱帶及亞熱帶地區，抗寒性較弱，是一種喜溫冷敏植物［14-16］。Maes等［17］進行的世界范圍內的調查表明，小桐子生長適宜的年均溫度為19.3-27.2℃，最低月均溫度要高于10.5℃。而隨著小桐子栽培的北移和向高海拔山區發展，低溫冷害已成為限制小桐子產業的主要環境因素［15-17］。為研究miRNA在小桐子低溫脅迫與適應過程中的調控作用，本課題組前期進行了小桐子小RNA-seq分析，初步獲得了差異表達與穩定表達的miRNA信息［18］，但要進行進一步qRTPCR驗證，需要篩選合適的內參基因用于miRNA定量分析。但目前尚未見對小桐子miRNA qRT-PCR內參基因篩選的報道。

本研究基于小桐子小RNA-seq數據［18］，篩選低溫處理前后表達量相對穩定的10個miRNA以及在其他物種miRNA定量分析中常用的U6作為候選內參，采用qRT-PCR方法對候選內參基因在低溫脅迫下的表達穩定性進行分析，以期篩選出可用于小桐子低溫脅迫下miRNA差異表達分析的穩定內參基因，為小桐子miRNA表達的定量分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 選取飽滿的小桐子種子，參照李忠光等［19］方法，用1.5% CuSO4溶液消毒，在恒溫培養箱中萌發5 d，將發芽的種子種在營養土中，在相對濕度75%、26/20℃、16/8 h光周期的培養箱中培養21 d，至第3片真葉展開［20］。

1.1.2 低溫處理 在小桐子長至第3片真葉展開時，轉入1℃光照培養箱中低溫處理5 d，每天取樣1次（LT1d-LT5d，取用第2片及以上展開真葉）。以未處理的小桐子作為對照1（C0d）；另在正常培養條件下第26天取樣作為對照2（C5d）。依據前期結果，在1℃處理5 d時，小桐子幼苗死亡率約70%［20-21］。

1.2 方法

1.2.1 樣品miRNA提取及cDNA合成 參照Plant miRNA Kit（OMEGA公司）說明書提取miRNA，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測miRNA的質量，NanoPhotometer-N60超微量分光光度儀（Implen，Germany）測定濃度，并通過OD260/OD280和OD260/OD230檢測miRNA的純度。采用miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit（Tiangen，北京）反轉 錄 cDNA。 反 應 體 系 為 Reaction Buffer 10 μL、Enzyme Mix 2 μL、miRNA 2 μL，加水至 20 μL。42℃孵育1 h，并在95℃加熱3 min失活逆轉錄酶（RT enzyme mix），進行miRNA加A尾反應以及cDNA第一鏈合成。cDNA用NanoPhotometer-N60超微量分光光度儀（Implen，Germany）測定濃度，每份樣本終濃度為100 ng/μL，取1 μL用于qRT-PCR。

1.2.2 qRT-PCR各供選基因引物設計 在11個候選內參基因中，U6snRNA序列來自于Jatropha curcas Database（JCDB）和NCBI；10個來自小桐子低溫脅迫下小RNA-seq［18］中表達穩定的miRNA，按照其序列設計引物，反向引物為：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′。 利 用 DNAMAN 8（Lynnon，USA）進行引物互補檢測，減少引物自身延伸或兩兩互補延伸形成二聚體的可能性（表1）。

表1 候選內參基因引物序列

1.2.3 qRT-PCR分析 根據TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNase H PLUS）試劑盒說明書配置10 μL反應體系，cDNA模板1 μL（10 ng/μL）、正反向引物各 0.4 μL（10 μmol/L）、2×TransStar Tip Green qPCR SuperMix 5 μL 和 ddH2O 3.2 μL。所有操作均在冰上進行，3個重復，3次生物學重復。反應程序為 95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，45 個循環，并在65-97℃進行熔解曲線分析。利用LightCycler?96 System（Roche，Switzerland）進行qRT-PCR反應。

1.2.4 數據處理 記錄qRT-PCR分析得出的基因轉錄水平Ct值，每個基因在不同處理樣本中的Ct值測定3個重復。qRT-PCR熔解曲線利用LightCycler 96 SW 1.1（Roche，Switzerland）軟件進行作圖及分析；利用 geNorm（https：//genorm.cmgg.be/）、NormFinder（https：//www.moma.dk/normfinder-software/） 和BestKeeper（https：//www.gene-quantification.de/bestkeeper.html）分析11個候選內參基因的表達穩定性；利用Microsoft Excel 2016進行數據作圖。

2 結果

2.1 miRNA質量檢測

通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的miRNA樣品（圖1）。可見提取的miRNA質量較好；各樣品中miRNA的OD260/OD280、OD260/OD230的值均大于1.8（表2），miRNA質量滿足后續實驗的需求。

圖1 提取的miRNA2%的瓊脂糖凝膠電泳圖

表2 7個miRNA樣品的純度與濃度

圖2 內參基因的qRT-PCR分析

2.2 引物擴增特異性分析

以miRNA cDNA第一鏈為模板進行qRT-PCR擴增，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖2）。11條內參基因條帶單一，通過測序、比對等檢測，確定擴增產物為引物特異性擴增產物，符合預期結果。

圖3 十一個候選內參基因的qRT-PCR熔解曲線

經熔解曲線分析，11條候選內參基因的熔解曲線均呈現明顯的單一峰（圖3），不存在引物二聚體，并且每個樣本的重復性較好，進一步說明引物的特異性，可進行后續實驗分析。

2.3 候選內參基因的表達分析

11個候選內參基因在不同溫度處理的小桐子葉片中，平均Ct值變化范圍為10.53-26.03（圖4），其中U6Ct值最小，miR2612Ct值最大（圖5）。

圖4 11個候選內參基因平均Ct值分布

圖5 各候選基因在不同處理下葉片組織中Ct值分布

2.4 內參基因的表達穩定性分析

利用GeNorm軟件對11個候選內參基因在不同處理下葉片組織中穩定性（M值）分析（圖6），M 值 由 高 到 低 為miR5672、miR5040、miR5535、miR1446、miR3624、miR5791、miR2612、miR159、miR3630、U6、miR6448，所選候選內參基因的M值均小于1.5，表明候選基因表達都較穩定，M值最低的是miR6448；其次是U6。可見miR6448在低溫脅迫下表達最穩定，其次是U6。

通過對不同處理下葉片組織中內參基因的NormFinder分析（表3），發現穩定值最小的是miR6448（0.088）；其 次 是U6（0.134）。 這 與GeNorm分析得出的結果一致。

圖6 不同處理下葉片組織中內參基因的GeNorm分析

表3 不同處理下葉片組織中內參基因的NormFinder分析

表4 不同處理下葉片組織中內參基因的BestKeeper分析

由BestKeeper分析標準偏差和變異系數，miRNA6448的標準偏差（0.18）和變異系數（0.78）都是最小的，表明miRNA6448在低溫脅迫下的小桐子中表達最穩定。

3 討論

進行qRT-PCR時，對內參基因的篩選非常有必要。內參基因在qRT-PCR中可以降低或校正基因定量過程中存在的誤差，選擇合適的內參基因對于基因定量表達的結果有重要意義［3，10］。而在選擇內參基因時，除內參基因的穩定性，內參基因的表達豐度也會影響qRT-PCR結果［13，22-23］。內參基因與所檢測基因之間的Ct值差異越小，擴增效率對計算結果的影響也會越小，計算的結果會更加準確［23］。如果目標基因和內參基因表達量（Ct值）過大，用內參基因來衡量目標基因的表達量就不完全可靠［10，23］。在本研究中，miR6448的 Ct值為 23左右，豐度適中，可以用于檢測qRT-PCR試驗中豐度較適中的轉錄本；U6的Ct值為10左右，可以用于miRNA qRT-PCR實驗中豐度較高的轉錄本檢測。

在進行miRNA研究時，提取的miRNA中往往棄除了mRNA等長鏈RNA，因此，相對鏈長較長的mRNA無法再用作miRNA定量研究的內參［24］。在qRT-PCR中，最常用的植物內參基因包括ACT、GAPDH、18S和F-BOX家族蛋白，通常在miRNA定量檢測中并不選擇這些內參基因［7-8］。常用于miRNA熒光定量的內參基因多為一些片段長度相對較短的基因，例如U6［3，25-26］。在大豆［27］、小麥［28］、龍眼［29］和百合［8］等植物 miRNA 的 qRT-PCR 分析中，miRNA的表達水平比最常用的ACT、GAPDH、F-BOX等蛋白質編碼基因穩定得多。

在miRNA的qRT-PCR分析時，常常需要根據不同的植物材料和處理條件來選擇合適的內參。茶樹低溫脅迫下，miRNA（PC-3p-222）在不同低溫處理以及不同茶樹組織中表達最為穩定，可作為茶樹低溫脅迫下miRNA的qRT-PCR的內參基因［30］。甘蔗芽在低溫脅迫下，miR171/18S rRNA和miR171/miR5059表達最穩定［31］。鹽脅迫下，U6適合作為大豆根組織miRNA研究的內參［32］。葡萄在鹽脅迫和低溫脅迫下，U6是表達最穩定的基因［1］。本研究發現，小桐子葉片組織對低溫脅迫處理響應的miRNA中，miR6448和U6的表達表現穩定。可見miRNA內參基因除特異性外，像U6這樣的基因也表現出一定的通用性。

4 結論

低溫脅迫下表達最穩定的基因是miR6448和U6。miR6448適用于表達豐度適中的microRNA基因表達定量分析中；U6適用于豐度較高的microRNA的qRT-PCR分析。