31種瑤藥提取物抑菌活性的篩選

楊若穎，李 嬋，葉明亮，張丹陽，馮俊濤,2，閆 合,2

(1.西北農林科技大學 植物保護學院，陜西 楊凌 712100；2. 西北農林科技大學 陜西省生物農藥工程技術研究中心，陜西 楊凌 712100)

植物源農藥的主要成分來源于自然，具有選擇性高、低毒、易降解，害物不易產生抗藥性等優點[1], 從植物中尋找抑菌活性物質, 是研發新型殺菌劑的熱點之一。瑤醫藥是瑤族人民長期與疾病作斗爭的智慧結晶，104 味經典老班藥中，很多是治療細菌感染的藥物，這為新型抑菌活性物質的發現提供了線索。事實上，雖然國內外對具農藥活性植物的篩選一直沒有停止，但針對瑤藥的農用活性篩選卻少見報道。本研究對我國部分瑤藥植物的甲醇提取物進行抑菌活性的篩選，旨在篩選出具有較高活性抑菌植物，為開發新型植物源農藥奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 煙草青枯菌(Ralstoniasolanacearum)和蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)由西北農林科技大學無公害農藥研究服務中心提供；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)標準菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923購買自廣東省微生物菌種保藏中心。供試瑤藥購買自廣西省南寧市大福子原生草藥店，并由西北農林科技大學生命學院李琰副教授鑒定。31種瑤藥及其科屬見表1。分析純甲醇和分析純DMSO購自四川西隴化工有限公司；電子天平， ALC-1100.2，北京賽多利斯儀器系統有限公司；旋轉薄膜蒸發儀，R205B型，上海申生科技有限公司；超聲波清洗器，KQ-250B，昆山市超聲儀器生產公司；循環水式多用真空泵，SHB-B95A型，鄭州長城科工貿易有限公司。

1.2 瑤藥樣品的提取 采用超聲波提取法將陰干的植物材料在40 ℃下烘干，粉碎后過40目篩，放入自封袋中。試驗前稱取50 g的植物干粉，加入甲醇進行超聲波提取，每次60 min，重復提取3次。過濾后濃縮，保存于4 ℃冰箱內待用。

1.3 培養基配制方法 室內生測用于活化細菌性病原菌菌株的液體培養液(LB培養基): 稱取胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉3 g, 加水定容至1 L, 滅菌鍋滅菌待用。

1.4 藥劑配制 采用對供試病菌沒有抑菌作用的二甲基亞砜作為溶劑, 將供試瑤藥提取物溶解。用二甲基亞砜-水溶液將各瑤藥提取物按其有效成分含量溶解稀釋成1 000 mg·L-1藥液 (作為母液備用)。

1.5 供試菌種的準備 將供試菌種在試驗前1 d轉接到LB培養液中, 置于28℃恒溫搖床箱中活化12 h。

1.6 室內抑菌活性篩選和最低抑菌濃度(MIC)測定方法 采用二倍稀釋法對瑤藥提取物進行室內抑菌活性篩選和最低抑菌濃度(MIC)測定[2]。測定方法: (1) 室內抑菌活性篩選方法：實驗操作在96孔板上進行, 每孔加入50 μL稀釋后細菌數量達104cfu·mL-1的供試菌菌懸液與50 μL質量濃度為1 000 mg·L-1藥液，使藥液最終濃度為500 mg·L-1，培養24 h后觀察結果；再進一步將母液稀釋為200 mg·L-1藥液，實驗操作方法同上，使藥液最終濃度為100 mg·L-1，培養24 h后觀察結果；(2) 最低抑菌濃度(MIC)測定方法：取編號為1～5的試管以及適量的蒸餾水，放入滅菌鍋里滅菌待用。滅菌完成后，除1號試管加入4 mL無菌水外，其余試管均加入2 mL無菌水。將1 mL配制好的質量濃度為1 000 mg·L-1的母液加入1號試管中，混合均勻后，將混合后的藥液取2 mL加入到2號試管中，以此操作至5號試管為止。使藥液濃度稀釋為200，100，50 ，25，12.5 mg·L-1共5個濃度。在96孔板上每孔加入50 μL稀釋后細菌數量達104cfu·mL-1的供試菌菌懸液與50 μL藥液，使藥液最終濃度為100，50，25，12.5，6.25 mg·L-1，以硫酸鏈霉素作為對照藥劑。培養24 h后，通過肉眼比對發現微孔內液體澄清透明經震蕩后仍無沉淀產生, 則此微孔對應的藥液濃度即為此提取物對待測病菌的MIC值。

2 結果與分析

2.1 31種瑤藥提取物對煙草青枯菌的室內抑菌活性篩選 采用二倍稀釋法在500，100 mg·L-1的濃度下，測定了31種瑤藥植物的甲醇提取物對煙草青枯菌的抑菌活性實驗，結果表明：在500 mg·L-1的濃度下有18種瑤藥提取物表現出顯著的抑菌活性，在100 mg·L-1的質量濃度下有3種瑤藥提取物表現出顯著的抑菌活性(表1)。

表1 供試瑤藥對煙草青枯的初篩活性

續表1 Continued Tab.1

注：1.對煙草青枯菌的活性測定采用二倍稀釋法；2.“抑菌活性”列，標注“+”和“-”分別表示該樣品“具顯著抑菌活性”和“無顯著抑菌活性”

Note：The activity ofRalstoniasolanacearumwas assayed by double dilution method; the ‘ +’ and ‘-’ in the column of inhibitory activity indicate 'significant inhibitory activity and no significant inhibitory activity, respectively.

2.2 抑菌活性顯著的瑤藥提取物的MIC測定結果 采用二倍稀釋法對穿破石、獨腳風、貫眾等3種瑤藥提取物進行最低抑菌濃度測定(表2)。結果表明：3種瑤藥提取物對煙草青枯菌、蠟狀芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌均有顯著的抑制效果。3種瑤藥提取物對煙草青枯菌的MIC分別為25，25，25 μg·mL-1，對蠟狀芽孢桿菌的MIC分別為12.5，50，50 mg·L-1，對金黃色葡萄球菌的MIC分別為50，25，50 mg·L-1。

表2 3種瑤藥提取物對煙草青枯菌、蠟狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC測定結果

續表2 Continued Tab.2

注：1.“-”表示無細菌生長，培養液澄清透明無沉淀；2.“+”表示有細菌生長，培養液渾濁有沉淀

Note：“-” indicates no bacterial growth, and the culture solution was clear, translucent and contained n precipitation; “+” indicates bacterial growth and the culture solution was not clear and contained precipitations.

3 討 論

我國對具農藥活性植物的篩選，一般是參考《本草綱目》等古籍和《中國土農藥志》《中國有毒植物》等專著及在生產中人們使用的土農藥[3]。前期，國內多位學者對我國陜、甘、青、新、寧、蘇、粵、桂、鄂、閩、川、黔等地區的2 000 多種野生植物或中草藥進行了農用活性的篩選，發現了砂地柏、牛心樸子、掌葉千里光、辛夷、廣陳皮、博落回等多種植物具有較好的殺蟲活性；茄科、百部科、藜科、馬錢科、豆科、菊科、仙茅科、玄參科、蕓香科、天南星科、姜科、唇形科、菊科、桔梗科、忍冬科、傘形科、蓼科、大戟科等植物的殺蟲活性值得深入研究；豆科、禾本科、菊科、傘形科、十字花科、馬兜鈴科、唇形科、葫蘆科、蓼科、木蘭科、百合科、木犀科、莎草科和樟科等植物的殺菌活性具開發應用前景。近 10 余年來，國內學者篩選的范圍進一步擴大，同時更加注重對植物源物質特殊生物活性的發現[4]。

瑤族是我國少數民族之一，在廣西生活的瑤族占全國瑤族總人口60%以上，大多聚居在金秀、巴馬、都安、大化、富川和恭城等6個瑤族自治縣內。瑤族人民在長期的生活實踐中總結出一套有效的防病、治病經驗，其方法簡單實用，療效確切。瑤醫藥是瑤族人民長期與疾病作斗爭的智慧結晶，具有鮮明的民族特色，瑤族醫藥歷來靠口傳心授、代代相傳而得以傳承。在各級政府和諸多瑤醫藥專家的共同努力下《瑤醫效方選編》《中國瑤醫學》《實用瑤醫學》《中國現代瑤藥》等著作先后出版，標志瑤醫藥的理論體系初步形成[5]。由于瑤族生活區域濕熱的氣候特點，使瑤藥具有不同于北方中醫藥系統的特色。104 味經典老班藥中，大多數為治療細菌感染的藥物，而這可以給殺菌劑的發現提供重要的線索。因此，本研究針對瑤藥開展抑菌農用活性篩選，采用二倍稀釋法篩選了31種瑤藥提取物的抑菌活性, 并測定了初篩高活性瑤藥提取物對煙草青枯菌、蠟狀芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度。結果表明，穿破石、獨腳風、貫眾3種瑤藥提取物均具有顯著抑制煙草青枯菌、蠟狀芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌等3種植物病原細菌的活性。

有研究表明，穿破石根提取物對梨銹病菌、稻瘟病菌、水稻紋枯病菌以及玉米炭疽病菌有很高的抑菌活性[6], 綿馬貫眾醇提液和水提液對金黃色葡萄球菌、甲型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、白喉桿菌等革蘭氏陽性菌有較強的抑制作用[7]。由此可見，穿破石、貫眾有多種抑菌活性，然而獨腳風的抑菌活性卻少見報道。因此，穿破石、獨腳風、貫眾這3種瑤藥有開發為新型植物源殺細菌劑的潛力，值得進一步深入研究。