雞樅菌液體發酵菌絲體的條件優化

王 坤 曲亮璠 王祥河 劉 然 許勤虎

1（天津量信檢驗認證技術有限公司，天津300462） 2（天津市工業微生物研究所有限公司，天津300462）

3（天津實發中科百奧工業生物技術有限公司，天津300462）

雞樅菌（Termitomyces albuminosus），又名雞肉絲菇、三壇菌，味道鮮美，風味獨特，營養豐富，具有寶貴的藥用價值，在我國主要分布在云南、貴州、四川三省以及臺灣的一些地區，是食用菌中的珍品之一。現代醫學研究證明，雞樅菌含有的多糖、多酚、皂苷、多肽等活性成分，有抗氧化、延緩衰老、降血脂、消炎鎮痛、提高機體免疫力等多種功效。大多數雞樅菌的生長發育與土白蟻的活動密切相關，兩者之間存在嚴格的共生機制，研究人員目前尚未探明其中機理，因此雞樅菌的馴化極其困難。在自然條件下生長的雞樅菌數量較少，且價格十分高昂，國內雖有對野生雞樅菌馴化栽培的研究，但至今還沒有獲得成熟的人工栽培技術，也未見有大規模生產該菌株的報道。采用液體發酵培養雞樅菌菌絲體方法簡便，發酵速度快，周期短，易于回收，可實現產業化生產，能夠廣泛應用于食品、保健品、藥品等行業，滿足日益增長的市場需求，創造經濟效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：雞樅菌。

試劑：葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉、蛋白胨、酵母膏、尿素、硝酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、維生素B1、B2、B6、B12等均為分析純；豆粕為市售。

1.2 儀器與設備

METTLER AE200分析天平，METTLER Seven Multi pH計；蘇州凈化SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺；日本三洋MLS-3750高壓滅菌鍋；鄭州長城SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵；上海博迅GZX-9146 MBE數顯鼓風干燥箱。

1.3 方法

1.3.1 雞樅菌液體發酵試驗

1.3.1.1 液體種子的制備

斜面培養基：馬鈴薯200.0g/L，葡萄糖20.0g/L，瓊脂20.0g/L。

液體種子培養基：葡萄糖4.0%，蛋白胨2.0%，磷酸二氫鉀0.2%，硫酸鎂0.1%，pH值自然。

液體種子的制備：將大小為1 cm2的斜面菌種接入裝液量為150/500 mL的搖瓶，溫度22℃，175 r/min搖床振蕩培養3 d。

1.3.1.2 發酵單因素試驗

選擇常見的蛋白胨、酵母膏、豆粕、尿素、硝酸銨作為氮源，葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉作為碳源，維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12為生長因子。各氮源添加量為2.0%，各碳源添加量為4.0%，各生長因子添加量為1.0 mg/L，磷酸二氫鉀0.2%，硫酸鎂0.1%，接種量7.5%，裝液量150/500 mL，pH值自然，溫度22℃，175 r/min搖床振蕩培養，發酵4 d后，以雞樅菌的生物量為指標，篩選出最佳液體培養基的碳、氮源組成。

分別選取不同葡萄糖添加量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）；不同豆粕添加量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）；不同維生素B1添加量（0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L、2.5 mg/L），磷酸二氫鉀0.2%，硫酸鎂0.1%，接種量7.5%，裝液量150/500 mL，pH值自然，溫度22℃，175 r/min搖床振蕩培養，發酵4 d后，以雞樅菌發酵產物中的菌絲體生物量為指標，確定碳源、氮源、維生素B1的最適添加量。

1.3.1.3 正交試驗

在上述單因素試驗結果的基礎上，進行三因素三水平正交優化試驗，以期獲得雞樅菌菌絲體最佳發酵條件和最大菌絲體產量。

1.3.2 菌絲體生物量測定方法

雞樅菌發酵產物中菌絲體的生物量通過細胞干重法測定，具體方法為：取發酵產物于布氏漏斗進行抽濾，棄去濾液，用蒸餾水將得到的雞樅菌菌絲體洗凈，重復上述操作，將得到的菌絲體置于60℃鼓風干燥箱中烘干至恒重。生物量按下式計算：

式中：X——菌絲體生物量，g/L；

W——菌絲體干重，g；

V——取樣體積，mL。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 不同碳源對雞樅菌發酵的影響

圖1 不同碳源對雞樅菌發酵的影響

培養基中不同碳源對雞樅菌發酵的影響如圖1所示。在菌絲體液體培養試驗中，碳源是除水分以外菌體細胞生長需要量最大的營養物質，為雞樅菌的生長、代謝和功效成分的累積提供能量，約占細胞干重的50%。雞樅菌菌絲體在葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉為碳源的液體培養基質中均能生長，且不同來源的單糖、雙糖、多糖對雞樅菌生物量的累積有不同的影響。當以葡萄糖為碳源進行液體發酵時，雞樅菌菌絲體生長旺盛，通過搖床振蕩培養的方式培養4 d后，菌絲體生物量達到24.55 g/L。當雞樅菌以可溶性淀粉為可利用碳源進行液體發酵時，菌絲體生長速度最為緩慢，菌絲體生物量最小為20.31 g/L。這可能是由于葡萄糖為小分子糖類，更容易被微生物利用和轉化，糖類的分子量過大，不利于發酵的進行，由試驗結果可知，雞樅菌液體發酵的最佳碳源為葡萄糖。

2.1.2 不同氮源對雞樅菌發酵的影響

培養基中不同氮源對雞樅菌發酵的影響如圖2所示。氮源的基本作用是為微生物生長過程中蛋白質以及核酸的合成提供原料，其成分及來源屬性將直接影響到微生物菌體的生長，進而影響相關功效成分的合成速度及最終得率。雞樅菌菌株在蛋白胨、酵母膏、豆粕、尿素、硝酸銨這幾種常見的有機、無機氮源的液體培養基質中均能增殖，且不同種類的氮源對雞樅菌生物量的累積有不同的影響。

圖2 不同氮源對雞樅菌發酵的影響

由圖2可知，菌株對豆粕、酵母膏等有機氮源的利用率高于無機氮源。當以豆粕為氮源時，雞樅菌菌絲體搖床振蕩培養4 d后，菌絲體生物量為24.55 g/L，高于其他氮源發酵菌絲體的產量。這可能是由于豆粕富含多種營養物質如維生素、氨基酸、未知生長因子等，有利于微生物發酵，可促進雞樅菌增殖，提高其菌絲體得率。因此，雞樅菌液體發酵的最佳氮源為豆粕。

2.1.3 不同生長因子對雞樅菌發酵的影響

培養基中不同生長因子對雞樅菌發酵的影響如圖3所示。大多數維生素是微生物代謝過程中某些酶的輔酶，與微生物體內的能量代謝，與碳水化合物、蛋白質、核酸和脂肪的生化反應息息相關。在液體搖瓶培養基中加入1.0 mg/L不同種類的維生素，可不同程度地促進菌株菌絲體的生長繁殖。

圖3 不同生長因子對雞樅菌發酵的影響

由圖3可知，維生素B1、B2、B6、B12作為生長因子添加到培養基中發酵4 d后，雞樅菌菌絲體生物量分別為 24.61 g/L、22.94 g/L、23.57 g/L、22.90 g/L，較對照組分別提高了9.86%、2.41%、5.22%、2.23%。維生素B1對雞樅菌液體發酵的影響最為明顯，因此將維生素B1作為雞樅菌液體培養的生長因子。

2.1.4 葡萄糖添加量對雞樅菌發酵的影響

培養基中葡萄糖含量對雞樅菌發酵的影響如圖4所示。碳源含量對微生物發酵有著重要的影響，添加量過少，無法滿足菌體生長需求，降低菌株生長速度；添加量過多，多余糖分無法被充分利用，增加發酵成本，降低經濟效益。由圖4可知，隨著液體培養基中碳源所占比例的增加，雞樅菌液體發酵所得菌絲體生物量也逐漸增加，當葡萄糖的添加量為3.0%時，菌株發酵得到的生物量為24.61 g/L，達到最大值；當培養基中的碳源添加量超過3.0%時，雞樅菌菌絲體生物量不再有明顯變化。因此，選擇葡萄糖的添加量為3.0%。

2.1.5 豆粕添加量對雞樅菌發酵的影響

培養基中豆粕含量對雞樅菌發酵的影響如圖5所示。氮是構成蛋白質和核酸類物質的主要元素，氮源是微生物的主要營養物質。

圖5 豆粕添加量對雞樅菌發酵的影響

由圖5可知，隨液體培養基中豆粕添加量的增加，菌株的菌絲體生物量呈迅速增加的趨勢，當豆粕添加量為2.0%時，菌絲生物量為24.23 g/L，達到最大值；當液體培養基質中的豆粕含量持續增加至5.0%，菌絲體的生物量不再有明顯的變化，說明適量增加氮源可促進雞樅菌的增殖，培養基中過量的營養物質并不能被菌株利用和轉化。因此，選擇豆粕的添加量為2.0%。

2.1.6 維生素B1添加量對雞樅菌發酵的影響

培養基中維生素B1含量對雞樅菌發酵的影響如圖6所示。由圖6可知，未添加維生素B1的對照發酵組通過搖床振蕩培養發酵4 d后，其菌絲體生物量達到22.21 g/L；維生素B1添加量在0.5 mg/L～2.5 mg/L的范圍內，雞樅菌生物量分別達到23.72 g/L、24.76 g/L、24.37 g/L、23.90 g/L。試驗結果表明，當以維生素B1為生長因子，添加量為1.0 mg/L時，對雞樅菌液體發酵的促進作用最明顯，相比于對照組菌絲體生物量增加了11.48%。因此，選擇維生素B1添加量為1.0 mg/L。

圖6 維生素B1添加量對雞樅菌發酵的影響

2.2 正交試驗

2.2.1 試驗因素與水平

根據單因素試驗結果，以葡萄糖添加量1.0%、2.0%、3.0%，豆粕添加量1.0%、2.0%、3.0%，維生素B1添加量0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L為影響因素和水平，以發酵產物中雞樅菌菌絲體生物量為指標進行正交試驗，正交因素與水平見表1，正交試驗結果見表2，方差分析見表3，驗證試驗見表4。

表1 因素水平表

表3 正交試驗方差分析結果

由表2和表3可知，葡萄糖、豆粕、維生素B1添加量3種因素對雞樅菌液體發酵菌絲體的生長均有顯著性影響；通過極差值和F值大小判斷3個因素對菌絲體生物量的影響主次順序為：葡萄糖添加量＞豆粕添加量＞維生素B1添加量。因素A葡萄糖以A3水平最適，因素B豆粕以B2水平最適，因素C維生素B1以C2水平最適，因此最佳發酵條件為：葡萄糖添加量4.0%，豆粕添加量2.0%，維生素B1添加量1.0 mg/L。

2.3 優化條件的驗證

表4 驗證試驗結果

由正交試驗優化出雞樅菌發酵菌絲體的最佳工藝（A3B2C2）并未在正交試驗表中出現，所以需要按照相應的優化條件進行驗證試驗，結果如表4所示。試驗結果表明，在葡萄糖添加量4.0%，豆粕添加量2.0%，維生素B1添加量1.0 mg/L的條件下，雞樅菌液體發酵的菌絲體生物量達到27.43 g/L，高于正交試驗點的所得數據，說明優化試驗真實有效。

3 結 論

本研究通過單因素試驗得出了不同碳源、氮源以及生長因子對雞樅菌生物量的影響，篩選出雞樅菌液體發酵的最適宜碳源、氮源、生長因子分別為葡萄糖、豆粕和維生素B1。通過正交試驗結果可知，不同因素對雞樅菌液體發酵菌絲體的影響大小順序依次為葡萄糖添加量＞豆粕添加量＞維生素B1添加量，說明碳源對于該菌種發酵的影響高于氮源和生長因子。通過正交試驗得到雞樅菌液體發酵的最優培養基組成為：葡萄糖添加量4.0%，豆粕添加量2.0%，維生素B1添加量1.0 mg/L，此條件下菌絲體生物量達到27.43 g/L。