木姜子精油/殼聚糖/乳清蛋白復合膜對枇杷品質的影響

孟金明，樊愛萍，吳依婕，曾麗萍

（紅河學院理學院，云南 蒙自 661199）

枇杷作為云南蒙自的特色水果之一，具有很高的觀賞價值和經濟價值。但是枇杷果實沒有后熟作用，需在樹上成熟后采收，且采摘后的枇杷易失水皺縮及受到機械傷害和病菌的侵染，很難進行長時間的貯藏和長距離運輸，這制約了枇杷種植業的發展[1-2]。目前，常采用低溫冷藏的技術延長枇杷的貨架期，低溫確實可以降低采后果實的呼吸，延長其貯藏時間，但由于枇杷果實具有低溫敏感性，經冷藏后枇杷果肉木質化嚴重，質地生硬，口感嚴重下降，降低其食用價值[3-4]。因此，找到一種有效處理采后枇杷的方式，減緩貯藏過程中冷害的發生，是枇杷保鮮急需解決的問題之一。

殼聚糖是甲殼素脫乙酰化的衍生物，無毒無害、可食用、可生物降解并具有良好的成膜性，是制作可食性包裝材料的理想原料[5]。乳清蛋白是奶酪工業的副產物，具有良好的乳化性、凝膠性及成膜性，是制造可食性膜常用的材料[6]。將殼聚糖與乳清蛋白兩種成膜材料進行復合可以彌補單一材料成膜后的一些物理性能上的缺陷，但是制成的復合膜在抑菌和抗氧化性能方面還存在缺陷。木姜子精油是從木姜子中提取得到的一種植物精油，具有抑菌效果、抗氧化性和對生物的趨避性等天然特性，在食品保鮮領域具有潛在應用價值[7]。本試驗將制成的可食性膜液用于采后枇杷的涂膜保鮮，研究其對冷藏枇杷木質化及相關酶活性的影響，為采后枇杷的貯藏保鮮提供理論依據及實踐指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料為蒙自的大五星枇杷果實，選擇無蟲害、無機械損傷，大小均勻、成熟度一致的枇杷果實作為試驗的材料。殼聚糖（脫乙酰度95%）：生工生物工程（上海）股份有限公司；乳清蛋白：美國Hilma 公司WPI9410；硫代巴比妥酸、鹽酸羥胺、溴化乙酰、三氯乙酸、磷酸二氫鈉、聚乙烯吡咯烷酮、鄰苯二酚、愈創木酚、氫氧化鈉、磷酸均為分析純（AR）：國藥集團化學試劑有限公司。

T6 新世紀紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；XHF-D 型高速分散器：寧波新芝生物科技股份有限公司；DHG-9070A 型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海齊欣科學儀器有限公司；TGL20M 型臺式高速冷凍離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；DHG-9070A 型電熱恒溫鼓風干燥箱：天津齊欣科學儀器有限公司；CP224C 型電子天平：上海奧豪斯儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 復合膜液的制備

參照陳悅等[8]方法，略作修改。取一定量的殼聚糖溶于2%乙酸的溶液中，配制成濃度為1%的殼聚糖乙酸溶液，再稱取一定量的乳清蛋白溶于去離子水中，配制成濃度為1%的乳清蛋白溶液，然后將兩者按3 ∶1（體積比）的比例混合，然后添加一定量的木姜子精油，制得木姜子精油添加量為總固形物質量的0%、3%、6%、9%、12%的復合膜液。

1.2.2 枇杷涂膜保鮮處理

先把選取好的枇杷分成大小均勻的5 份，將枇杷分別置于不同木姜子精油濃度的膜液中浸泡1 min，取出后自然晾干，于8 ℃恒溫恒濕箱下貯藏，每隔5 d 取樣測定各項指標，每個指標重復測定3 次。

1.2.3 保鮮指標的測定

1.2.3.1 失重率

采用稱量法測定[9]。

1.2.3.2 果實出汁率的測定

參照張瑜等[10]方法進行測定。

1.2.3.3 丙二醛（malondialdehyde，MDA）的測定

參照Pasquariello 等[11]方法進行測定，稱取枇杷2.5 g，加 0.2 g 聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP），7.5mLpH=8.8 硼酸緩沖液，冰浴下研磨，4 000 r/min離心15 min，取上清液0.5 mL 酶液，加1.5 mL 0.5%硫代巴比妥酸 （4，6-Dihydroxy-2-mercaptopyrimidine，TBA）溶液（用20%的三氯乙酸配成），沸水浴20 min，迅速冷卻然后12 000 r/min 離心10 min，取上液分別于450、532 nm 和 600 nm 處測定其 OD 值，計算如公式所示：

MDA 含量 （μmol·g-2）=[6.45×（OD532-OD600）-0.56×OD450]×V×（A/a）/W

式中：V 為提取液總量，mL；A 為反應液總量，mL；a 為測定提取液量，mL；W 為材料重，g。

1.2.3.4 木質素含量的測定

參照Morrison[12]的方法，稱取4 g 果肉，加入5 mL 95%乙醇溶液冰浴研磨，在4 500 r/min 離心20 min，用95%的乙醇沖洗沉淀 3 次，再用乙醇-正己烷（1 ∶2，體積比）沖洗3 次，收集沉淀并干燥，將干燥物溶于25%溴化乙酰冰醋酸溶液，70 ℃恒溫水浴30 min，加入1 mL 2 mol/L 的NaOH 溶液終止反應，再加5 mL 冰醋酸和0.1 mL 鹽酸羥胺，用冰醋酸定容至10 mL。在280 nm處測定樣品提取液吸光值，結果以OD280nm/gFW 表示，測定3 次重復。

1.2.3.5 多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的測定

參照詹嘉紅等[13]方法測定PPO 活性，稱取5 g 果肉加入5 mL 含2 g PVP 的磷酸緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 6.5），冰浴研磨，然后 4 ℃ 12 000 r/min 離心 20 min，取0.1 mL 上清液加入1.9 mL 0.1 mol/L 磷酸緩沖液，1 mL 0.1 mol/L 的鄰苯二酚溶液，在420 nm 下測定混合液3 min 內吸光度值的變化（每30 s 記錄一次）。酶活性以每分鐘吸光度值變化0.01 個單位為一個酶活單位，結果以U/gFW 表示，測定3 次重復。

1.2.3.6 過氧化物酶（peroxidase，POD）的測定

參照曹建康等[14]方法進行測定，酶液提取同PPO，取0.1 mL 酶液加入2.7 mL pH 6.5 0.2 mol/L 的磷酸緩沖液、0.1 mL 4 %的愈創木酚、0.1 mL 0.5 % H2O2。于470 nm 處測定10 min 內吸光度的變化值。酶活性以每分鐘吸光度值變化0.01 個單位為一個酶活單位，結果以U/gFW 表示，測定3 次重復。

1.2.3.7 苯丙氨酸解氨酶（phenylalaninammo-nialyase，PAL）的測定

參照ZHAO 等[15]方法進行測定，稱取2.5 g 果肉，加入 7.5 mL 含 0.2 g PVP 的硼酸緩沖液（pH 8.8），冰浴研磨，4 000 r/min 離心15 min，取0.2 mL 上清液加入3 mL 硼酸緩沖液（pH 8.8），0.5 mL 0.02 mol/L 苯丙氨酸，37 ℃水浴加熱1 h，于290 nm 處測定吸光值，酶活性以每分鐘吸光度值變化0.001 個單位為一個酶活單位，結果以U/gFW 表示，測定3 次重復。

1.3 數據分析

采用Origin2017 軟件進行數據的初步處理及作圖，用SPSS Statistics 19.0 軟件進行顯著性分析，認為P＜0.05 時差異顯著，試驗結果用均值±標準差（±n，n=3）表示。

2 結果與分析

2.1 復合膜處理對冷藏枇杷果實出汁率的影響

隨著貯藏時間的延長，枇杷表面及內部的水分不斷散失，造成枇杷果皮皺縮不易剝離，可溶性果膠含量不斷下降，果肉變硬和品質下降。復合膜處理對冷藏枇杷果實失重率和出汁率的影響見圖1。

從圖1a 可以看得出，隨著貯藏時間的延長，枇杷果實的失重率不斷升高，在整個貯藏期對照組的失水比較嚴重，果皮褶皺最為嚴重，而處理組的枇杷失重率明顯低于對照組（P＜0.05），從感官上看果實的褶皺情況也明顯好于對照組；從圖1b 可以看得出，枇杷果實的出汁率隨貯藏時間的延長不斷降低，3%和6%處理組的枇杷出汁率明顯要優于對照組和其他處理組。這可能是由于膜溶液在枇杷果實表面形成一層薄膜，產生一種微氣調環境，抑制了其呼吸作用，從而減少了枇杷重量的損失[16]。隨著木姜子精油添加量的繼續增加，枇杷果實的出汁率下降，推測可能與藥害[17]反應有關。

圖1 復合膜處理對冷藏枇杷果實失重率和出汁率的影響Fig.1 Effect of composite membrane treatments on weight loss and juice percentage of loquat fruits during cold storage

2.2 復合膜處理對冷藏枇杷果實MDA含量的影響

MDA 就是膜脂過氧化的重要產物。它可以與蛋白質氨基酸殘基或核酸反應生成西弗堿，破壞細胞完整性，降低膜的穩定性，促使果實衰老和腐爛。其含量是衡量果實細胞膜通透性的重要指標，間接反映了膜損傷的程度[18]。復合膜處理對冷藏枇杷果實MDA 含量的影響見圖2。

圖2 復合膜處理對冷藏枇杷果實MDA 含量的影響Fig.2 Effect of composite membrane treatments on MDA of loquat fruits during cold storage

從圖2可以看出，隨著貯藏時間的延長，枇杷果實中MDA 的含量持續增加。在貯藏前期MDA 含量增加較緩慢，到儲藏后期15 d 以后，6%濃度的處理組果實MDA 含量顯著低于對照組（P＜0.05），其他處理組的MDA 的含量也低于對照組。說明了涂膜處理能有效抑制膜脂過氧化作用，減少果實MDA 的含量。這可能是由于經過木姜子涂膜處理，枇杷果肉中清除自由基的酶活力增強，枇杷的膜脂過氧化作用受到抑制，MDA合成量降低，從而保護了細胞膜的完整性，有效保持冷藏枇杷的品質。

2.3 復合膜處理對冷藏枇杷果實木質素含量的影響

木質素為植物次生代謝的產物，是植物細胞壁的二級結構的主要成分，其含量的高低直接反映了果實的衰老程度，進而直接影響果實的質量[19]。枇杷發生冷害的最重要特征就是果肉木質素含量升高，果肉組織質地老化。復合膜處理對冷藏枇杷果實木質素含量的影響見圖3。

圖3 復合膜處理對冷藏枇杷果實木質素含量的影響Fig.3 Effect of composite membrane treatments on lignin of loquat fruits during cold storage

從圖3中可以看出，在貯藏前期木質素的含量增加緩慢，隨后增加迅速，在貯藏后期趨于平緩。枇杷果實木質素含量與木姜子精油濃度呈負相關關系，木姜子精油濃度越高，木質素水平越低，但當木姜子精油濃度達到一定水平后，增加木姜子精油濃度，枇杷果實木質素含量沒有明顯的降低。第10 天開始，3%和6%處理組木質素含量明顯低于對照組（P＜0.05）且與這兩個處理組之間不存在顯著性差異?？梢娡磕ぬ幚砟軌蛴行Ы档凸麑嵞举|素含量，延緩了其老化進程，減緩了枇杷冷害的發生。

2.4 復合膜處理對冷藏枇杷果實PAL的影響

冷藏枇杷果肉組織中木質素的合成是一個復雜過程，是各種酶和非酶物質協同作用的結果，目前對催化木質素生物合成的酶類研究較多的是PPO、PAL、POD。木質素是植物苯丙烷代謝途徑的主要終產物之一，PAL 是催化苯丙烷類代謝第一步反應的酶，是苯丙烷類代謝的關鍵酶和限速酶，PAL 可以作為木質化開始的標志酶[20]。低溫條件下可以引起細胞壁物質代謝異常，PAL 活性上升，木質素和纖維素含量增多，導致果肉木質化敗壞。復合膜處理對冷藏枇杷果實PAL 的影響見圖4。

圖4 復合膜處理對冷藏枇杷果實PAL 的影響Fig.4 Effect of composite membrane treatments on PAL activity of loquat fruits during cold storage

從圖4可以看出所有試驗組枇杷PAL 活性呈先上升后降低的趨勢，在貯藏的第10 天到達最高值，但是6 %處理組PAL 活性峰值與對照組相比降低了24.65%，在貯藏的后期涂膜組的PAL 活性也低于對照組。說明用木姜子/殼聚糖涂膜處理，能有效的抑制PAL 活性，因為PAL 是枇杷木質化過程中的關鍵酶和限速酶，所以能在一定的程度上減緩枇杷在冷藏的過程中的木質化進程。

2.5 復合膜處理對冷藏枇杷果實POD的影響

POD 是促進木質素合成的關鍵酶之一，在木質素生物合成的最后一中POD 催化H2O2的分解，聚合木質素單體，促進組織木質素的合成，加速組織木質化過程并加速其衰老敗壞[21]。復合膜處理對冷藏枇杷果實POD 含量的影響見圖5。

圖5 復合膜處理對冷藏枇杷果實POD 含量的影響Fig.5 Effect of composite membrane treatments on POD activity of loquat fruits during cold storage

從圖5可以看得出，隨著貯藏時間的延長枇杷果實POD 的活性呈現出先升高后緩慢降低的趨勢，在貯藏的第10 天到達最高值，在貯藏的前15 天6%處理組POD 酶活性明顯低于對照組（P＜0.05），在貯藏的后期3%和9%處理組POD 酶活性較低，兩處理組POD活性差異不顯著（P＞0.05）。說明用木姜子/殼聚糖涂膜處理，能有效的抑制POD 活性的增加，減少組織木質素的合成，減緩其木質化進程。

2.6 復合膜處理對冷藏枇杷果實PPO的影響

PPO 是酚類物質合成的一個關鍵酶。在PPO 的作用下，既可以將組織中的酚類氧化引起組織顏色變化，又可以催化香豆酸轉化成咖啡酸，參與木質素的合成[22]。復合膜處理對冷藏枇杷果實PPO 的影響見圖6。

圖6 復合膜處理對冷藏枇杷果實PPO 的影響Fig.6 Effects of composite membrane treatments on PPO activity of loquat fruits during cold storage

從圖6可知，隨著貯藏時間的延長PPO 活性呈上升的趨勢，在貯藏的前期，處理組PPO 活性與對照組差異不顯著（P＞0.05），貯藏到10 d 后6%處理組PPO活性明顯低于對照組兩者存在顯著性差異（P＜0.05），其PPO 活性總體低于其他處理組。說明用復合膜液涂膜處理，能有效的抑制PPO 活性的增加，一方面降低了枇杷果實褐變的程度，另一方面影響了組織木質素的合成，緩解低溫對枇杷的影響，延長了貨架期。

3 討論與結論

植物精油是從植物的花、種子、莖、葉、根等部位萃取出來的，且具有芳香性和揮發性的一類油狀液體物質，是植物體內的次生代謝產物，具有抑菌效果、抗氧化性和對生物的趨避性等天然特性[23]。近年來，國內外應用植物精油在果蔬保鮮方面的研究較多。紀雨薇等[24]研究楓香葉分離物對枇杷的貯藏保鮮效果，發現10 mg/100 mL 的楓香葉分離物可以有效控制枇杷果實腐爛指數、硬度、細胞膜滲透性及PAL 活性和POD 活性的升高，延緩可溶性固形物、可滴定酸含量的下降和木質素的積累。尚艷雙等[25]研究楓香葉精油對低溫貯藏枇杷的防腐保鮮效果，得出6 μL/100 mL的楓香葉精油處理可以顯著延緩果實硬度上升和木質素的積累，減少果實腐爛、質量損失和丙二醛含量，減緩可溶性固形物的降低，抑制POD 和PAL 的活性。

本試驗在8 ℃貯藏條件下，以未經涂膜的枇杷作為對照，探討不同木姜子濃度的殼聚糖/乳清蛋白膜液對枇杷冷藏期間木質化的影響。試驗結果表明木姜子精油（6%）/殼聚糖/乳清蛋白膜液涂膜處理枇杷果實可以明顯降低其水分的散失，提升了其出汁率，維持果實的硬度，維持貯藏枇杷果實的品質；經過涂膜處理，枇杷果實MDA 的含量明顯降低，枇杷的膜脂過氧化作用受到抑制，細胞膜的完整性得到保護，延長了枇杷的貨架期。對于冷藏枇杷果實木質化影響的研究得出木姜子/殼聚糖涂膜處理可以明顯抑制木質素合成相關的酶PPO、POD、PAL 的活性，進而減緩了其木質素的合成，降低了其木質素的含量，減緩貯藏過程中冷害的發生，延長了枇杷果實的貨架期，使用6%濃度的木姜子殼聚糖乳清蛋白膜溶液處理組的結果要明顯優于對照組及其他處理組。