響應面法優化菌株發酵冷凍調理羊肉工藝

母應春，鄭璞，李秋桐，蘇偉，母雨

（貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

冷凍調制食品是以水產品、農產品或畜產品為主要原料，經調制加工，并急速冷凍保持凍結狀態的冷凍食品[1]。冷凍調理食品在種類上不勝枚舉，主要歸為五大類：中式點心、火鍋用料、裹面油炸品、菜肴料理、糕餅點心[2]。畜類冷凍調理肉制品即對原料肉進行前處理，如標準化的注射、滾揉、腌制等工藝，消費者只要購回進行解凍，通過蒸煮、煎炒、燒烤或微波加熱等簡單的烹飪手段即可食用[3]。常見的研究包括調理雞肉[4-5]、調理牛肉[6-7]、調理豬肉[8-9]等工藝，但用菌種發酵冷凍調理肉制品卻鮮有報道。

本試驗將采用篩出的米根霉TZH3 與米曲霉TZH4 對羊肉進行發酵，制成冷凍調理羊肉制品。通過試驗已經證實，米根霉TZH3 與米曲霉TZH4 不僅能夠產生脂肪酶，能對羊肉脂肪進行水解，還能夠降解4-甲基辛酸和4-乙基辛酸等膻味脂肪酸，能對羊肉的風味進行改善。通過對原料預處理、修整、注射菌液、加料、滾揉、腌制等工藝流程，選擇菌種接種量、保水劑添加量、發酵溫度和發酵時間為自變量，以冷凍調理羊肉熟制后的產品感官評定和pH 值為響應值，以獲得菌種發酵冷凍調理羊肉的最優配方。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白山羊原料肉：沿河鑫龍農牧開發有限責任公司。

大豆蛋白：谷神生物科技集團有限公司；食鹽：云南省鹽業有限公司；味精：廣州奧桑味精有限公司；白糖：太古糖業有限公司；冰水。

PDA 培養基：馬鈴薯浸粉 5.0 g、葡萄糖 20.0 g、瓊脂 15.0 g、氯霉素 0.1 g、蒸餾水 1 000 mL，pH7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；電熱恒溫培養箱（DPH-420 型）：天津天泰儀器有限公司；電子天平（FA2004N）：上海青海儀器有限公司；肉類pH 計（HI98163）：意大利哈納儀器公司；便攜式色差儀（NR200）：深圳市三恩時科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 調理羊肉的配方

選用優質白山羊后腿肉，去皮去筋膜及其附屬物后，向腿肉中注射菌劑，隨后將大豆蛋白、2%的食鹽、0.5%的味精和0.5%的蔗糖溶解在10%的冰水中，充分涂抹在羊腿肉表面。

1.3.2 調理羊肉的制作工藝及操作要點

原料預處理→修整→注射菌液→加料→滾揉→腌制→微凍→切片→包裝→成品

1.3.2.1 原料預處理

取排酸后的白山羊后腿肉，去掉皮，去掉筋膜及其附屬物。

1.3.2.2 修整

將羊腿肉塊修切整齊，便于后期切片大小均勻。

1.3.2.3 注射菌劑

注射菌劑時，應用注射器在不同方面扎多個孔，使菌劑分布均勻，發酵完全。

1.3.2.4 加料

將大豆蛋白、食鹽、味精和蔗糖溶解在冰水中，攪拌均勻后對羊腿肉進行涂抹，使輔料充分附著在肉表面。

1.3.2.5 滾揉

滾揉時應注意力度，使羊腿肉得到充分按摩。

1.3.2.6 腌制

腌制時用保鮮膜將羊腿肉包好，放于30 ℃下靜置腌制一段時間。

1.3.2.7 微凍

將腌制好的羊腿肉取出，置于-4℃下進行微凍3h。

1.3.2.8 切片

將凍好的羊腿肉取出，切成0.5 mm 左右厚度的肉片，使肉片大小厚度形狀均勻。

1.3.2.9 包裝

將處理好的肉片裝入聚乙烯蒸煮袋中，擺放好后抽真空包裝即為成品，于-18 ℃下冷凍保藏。

1.3.3 發酵菌劑的制備

參照李靜雯等[10]的方法，將保存于斜面中的米根霉TZH3 與米曲霉TZH4 活化2 代，接種到新的PDA斜面培養基中，30 ℃下培養72 h。培養完畢后，向斜面培養基中加入5 mL 無菌水并輕輕刮下孢子，重復4次，將清洗所得孢子液合并于盛有無菌玻璃珠的三角瓶中，反復振蕩后用滅菌脫脂棉進行過濾，得到的孢子液即為發酵用菌劑，調整孢子液濃度為108cfu/mL，米根霉TZH3 與米曲霉TZH4 按照體積比1 ∶1 進行復配，備用。

1.3.4 單因素試驗

以感官評分、pH 值、色差和蒸煮損失率為評價指標，探究菌種接種量、大豆蛋白添加量、發酵時間、發酵溫度對調理羊肉的影響，以不添加菌種和大豆蛋白的羊肉為空白對照組。單因素試驗設計中各因素的水平如表1所示。

表1 單因素試驗中各因素水平表Table1 Levels of independent variables used for single method

1.3.5 響應面試驗

結合單因素試驗結果，以pH 值為響應值，選取對產品影響較大的因素進行響應面試驗設計中心組合試驗，確定制作冷凍調理羊肉的最佳工藝條件。

1.3.6 感官評定

選擇10 名具有食品專業背景的人員作為感官評定小組，對羊肉的色澤、香氣、滋味、口感和組織狀態進行評分，感官評價標準和評分[11]如表2所示。

表2 感官評分標準Table 2 Criteria for sensory evaluation of sausage

1.3.7 pH 值、色差和蒸煮損失率的測定

使用肉類pH 計對調理羊肉的pH 值進行測定，利用便攜式色差儀對調理羊肉的亮度值（L*）、紅度值（a*）和黃度值（b*）進行測定，蒸煮損失率的計算為：蒸煮損失/%=（蒸煮前樣品質量－蒸煮后樣品質量）/蒸煮前樣品質量×100[12]，每個樣品平行測定3 次。

1.3.8 數據處理

每個試驗做3 個平行，測定結果以平均數±標準偏差表示，并利用SPSS 20.0 和Design-Expert V 8.0.6軟件對試驗數據進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1

菌種接種量對調理羊肉感官評分及pH 值的影響見圖1。

圖1 接種量對調理羊肉感官評分和pH 值的影響Fig.1 Effect of inoculum size on sensory score and pH value of conditioned lamb

由圖1可知，當菌種接種量為1.5%時，調理羊肉的的感官評分最高為（34.1±0.88）分，此時調理羊肉的pH 值為5.24±0.02；當菌種接種量為1.0%時，調理羊肉的感官評分最低為（18.7±0.95）分，此時調理羊肉的pH 值為5.35±0.08。菌種接種量為1.5%和2.0%的調理羊肉，其感官評分顯著高于接種量為1.0%、2.5%和3.0%的調理羊肉（P ＜0.05）。說明調理羊肉的pH 值隨著菌種的接種量增加而降低。米根霉（Rhizopus oryzae）是目前發酵生產L-乳酸的重要菌株[13]，L-乳酸常用作酸味劑、防腐劑。乳酸鹽能改善肉制品的嫩度、風味、顏色等，但是高濃度的乳酸鹽會影響肉制品中蛋白質的表達和穩定性[14]。米曲霉（Aspergillus oryzae）能將糖類物質轉化為曲酸，曲酸具有較強的抗氧化活性，能夠對肉制品起到一定的護色作用，同時曲酸還具有一定的金屬離子螯合能力，特別是能夠與肌紅蛋白中的三價鐵離子螯合生成血紅色，據此可取代亞硝酸鹽作為發色劑應用于肉類食品的加工領域[15]。因此，當菌種接種量過多時，產酸過多導致pH 值過低，對調理羊肉的色澤、香氣和滋味等造成一定的影響，因此感官評分降低；當菌種接種量過少時，調理羊肉發酵不充分導致固有膻味較重，香味較淡，因此感官品質較差。

菌種接種量對調理羊肉的色差影響見表3。

表3 接種量對調理羊肉色差的影響Table 3 Effect of inoculum size on color difference of conditioned lamb

由表3可知，空白組和接種量為2.5%調理羊肉的L*值顯著高于其他處理組（P ＜0.05）；空白組和接種量為3.0%的a*值顯著高于其他處理組（P ＜0.05）；空白組的b*值顯著高于其他處理組（P ＜0.05）。

菌種接種量對調理羊肉蒸煮損失率的影響見圖2。

圖2 接種量對調理羊肉蒸煮損失率的影響Fig.2 Effect of inoculum size on cooking loss rate of conditioned lamb

由圖2可以看出，菌種接種量為1.0%的調理羊肉蒸煮損失率最高為（40.33±0.31）%，菌種接種量為2.5%的調理羊肉蒸煮損失率最低為（34.72±0.43）%，且各處理組間的差異顯著（P ＜0.05）。隨著菌種接種量的增加，調理羊肉的蒸煮損失率明顯降低。霉菌能產生蛋白酶，由于酶的作用，使肉中的肌細胞由緊張變為松弛狀態，使得肉的持水力增加，蒸煮損失率顯著降低[16]。

2.1.2 大豆蛋白添加量對調理羊肉的影響

大豆蛋白添加量對調理羊肉感官評分及pH 值的影響見圖3。

圖3 大豆蛋白添加量對調理羊肉感官評分和pH值的影響Fig.3 Effect of soy protein addition on sensory score and pH of conditioned lamb

由圖3可知，當大豆蛋白添加量為3.0%時，調理羊肉的的感官評分最高為（35.7±0.67）分，此時調理羊肉的pH 值為5.16±0.04；當大豆蛋白添加量為0.5%時，調理羊肉的感官評分最低為（16.1±0.99）分，此時調理羊肉的pH 值為5.19±0.06。大豆蛋白接種量為3.0%的調理羊肉，其感官評分顯著高于大豆蛋白添加量為 0.5 %、1.0 %、2.0 %和 5.0 %的調理羊肉（P ＜0.05）。肉制品在加熱熟制過程中，肉蛋白會形成一個凝膠基質，將其他成分裹在中間。加熱時肉類蛋白形成的網絡基質將植物蛋白、多糖等添加物包埋在其中，從而增加了凝膠的硬度，咀嚼性也隨之提高[17]。經冷凍過后的調理羊肉蒸煮損失率增加，隨著水分的損失羊肉的色澤、口感等會有所變化，而大豆蛋白等保水劑的添加能對調理羊肉的品質起到保護和修飾的作用。因此隨著大豆蛋白添加量的增多，調理羊肉的感官評分上升。但當大豆蛋白添加過多時，羊肉固有的香味被掩蓋，并含有較多殘渣，對調理羊肉的香氣和口感等造成影響，因此感官品質有所下降。

大豆蛋白添加量對調理羊肉的色差影響見表4。

由表4可知，空白組調理羊肉的L*值與其他處理組的差異顯著（P ＜ 0.05），a*值同理；空白組與大豆蛋白添加量為0.5%的b*值無顯著差異，而與其他處理組的差異顯著（P ＜0.05），說明大豆蛋白的添加對調理羊肉的色澤具有明顯的影響。

大豆蛋白添加量對調理羊肉蒸煮損失率的影響見圖4。

表4 大豆蛋白添加量對調理羊肉色差的影響Table 4 Effect of soy protein addition on color difference of conditioned lamb

由圖4可知，隨著大豆蛋白添加量的增加，調理羊肉的蒸煮損失率降低，當大豆蛋白添加量為5%時，調理羊肉蒸煮損失率顯著低于其他處理組（P ＜0.05），為（30.66±0.48）%。吳立根等[18]向雞胸肉中添加全溶大豆蛋白（60%）的效果明顯，當添加量為7%時，雞胸肉的蒸煮出品率達到最佳為102.01%，證實了大豆蛋白在提高肉的保水性有著積極的意義。但由于過量蛋白粉影響了對調理羊肉的評價，綜上所述選擇3.0%的大豆蛋白添加量較適宜。

2.1.3 發酵時間對調理羊肉的影響

發酵時間對調理羊肉感官評分及pH 值的影響見圖5。

由圖5可知，調理羊肉的pH 值隨著發酵時間的延長而呈現出下降的趨勢，當發酵時間為12 h 時，調理羊肉的感官評分最高為（31.7±0.95）分，此時調理羊肉的pH 值為5.55±0.02；當發酵時間為20 h 時，調理羊肉感官評分最低為（18.9±0.99）分，此時的調理羊肉的 pH 值為 5.01 ± 0.02。調理羊肉發酵 20 h～24 h 時，調理羊肉的pH 值過低，酸味較重，對羊肉原有的鮮美滋味造成影響，咀嚼性有所提高，色澤較差。張寧等[19]在研制乳酸菌發酵牦牛骨泥香腸工藝的過程中，發現隨著香腸發酵時間延長，香腸pH 值值會逐漸降低，因為隨著發酵時間的增加，菌的活性逐漸增強，產酸能力也隨之增強，所以pH 值下降較快。但到達一定時間后，pH 值下降越來越不明顯，這是因為過低的pH 值已經不是合適該乳酸菌生長，因此pH 值不再持續下降。發酵時間過長時，乳酸菌產酸較多，會使香腸整體口味偏酸，進而影響人們的食欲。與本試驗結果一致。

發酵時間對調理羊肉的色差影響見表5。

圖5 發酵時間對調理羊肉感官評分和pH 值的影響Fig.5 Effect of fermentation time on sensory score and pH value of conditioning lamb

表5 發酵時間對調理羊肉色差的影響Table 5 Effect of fermentation time on color difference of conditioned lamb

由表5可知，空白組調理羊肉的L*值與其他處理組的差異顯著（P ＜ 0.05），b*值同理；空白組和發酵時間為 16 h 的 a*值差異不顯著（P ＜ 0.05）。

發酵時間對調理羊肉蒸煮損失率的影響見圖6。

由圖6可知，隨著發酵時間的延長，調理羊肉的蒸煮損失率減少，說明菌種在發酵時對羊肉的質構特性造成影響，對羊肉的保水性具有一定的積極作用。當發酵時間為16 h，調理羊肉的蒸煮損失率達到最低為（35.27±0.20）%。發酵時間越短，調理羊肉的pH 值降低得越慢，菌株產生的蛋白酶在低酸性條件下達到等電點，導致蛋白質溶解度降低，酶活性下降[20]，肉的持水力降低，因此蒸煮損失率較高，說明菌株產生的蛋白酶可能在酸性條件下活性較強。綜上所述，選擇16 h發酵時間較為適宜。

2.1.4 發酵溫度對調理羊肉的影響

發酵溫度對調理羊肉感官評分及pH 值的影響見圖7。

圖6 發酵時間對調理羊肉蒸煮損失率的影響Fig.6 Effect of fermentation time on cooking loss rate of conditioned lamb

圖7 發酵溫度對調理羊肉感官評分和pH 值的影響Fig.7 Effect of fermentation temperature on sensory score and pH value of conditioning lamb

由圖7可知，當發酵溫度為30 ℃時，調理羊肉的感官評分最高為（32.4±0.52）分，且顯著高于其他處理組（P ＜ 0.05），此時調理羊肉的 pH 值為 5.15 ± 0.04；當發酵溫度為15 ℃時，調理羊肉的感官評分最低為（18.0±0.94）分，此時調理羊肉的pH 值為5.36±0.06。黃丹等[21]對四川傳統發酵肉中乳酸菌進行分離鑒定，并對其發酵特性進行研究，發現溫度對于菌株生長及產酸影響較大。當環境溫度為20 ℃～30 ℃，分離菌株的OD 值與總酸逐漸升高，當溫度高于最適溫度30 ℃時，其OD 值開始下降；當溫度繼續升高，菌株的生長及產酸能力受到極大的抑制。調理羊肉的pH 值在15 ℃～30 ℃逐漸下降，而在35 ℃時呈上升趨勢，說明過高或過低的溫度不利于菌種的生長，產酸不足導致pH 值較高，影響了調理羊肉的色澤、香味和滋味等，因此感官評分降低。當發酵溫度為45 ℃時，接種的菌種生長受到抑制，但由于環境中的其他優勢菌種開始生長繁殖，因此pH 值持續下降，但調理羊肉失去原有香味并稍有異味，感官評分降低。

發酵溫度對調理羊肉的色差影響見表6。

表6 發酵溫度對調理羊肉色差的影響Table 6 Effect of fermentation temperature on color difference of conditioned lamb

由表6可知，空白組與發酵溫度為15 ℃調理羊肉的L*值差異不顯著（P ＜0.05）；空白組與其他處理組的a*值差異顯著（P ＜0.05），空白組與其他處理組的b*值差異同樣顯著。

發酵溫度對調理羊肉蒸煮損失率的影響見圖8。

圖8 發酵溫度對調理羊肉蒸煮損失率的影響Fig.8 Effect of fermentation temperature on cooking loss rate of conditioned lamb

由圖8可知，當發酵溫度為45 ℃時，調理羊肉的蒸煮損失率最高為（44.06±0.60）%，且顯著高于其他處理組（P ＜ 0.05）；當發酵溫度為 15 ℃時，調理羊肉的蒸煮損失率最低為（37.20±0.31）%。說明隨著發酵溫度的升高，菌株產酶活性較差，同時調理羊肉中的水分損失增加，不能保留羊肉原有的品質。因此，選擇發酵溫度30 ℃較適宜。

綜上所述，當 pH 值在 5.15～5.55 之間，調理羊肉的感官評分最高，此時調理羊肉的香氣、滋味和口感等較為適宜，該條件下有利于米根霉和米曲霉的的生長繁殖和脂肪酶的產生，能對羊肉的風味起到改善的作用。在不同的菌種接種量、大豆蛋白添加量、發酵時間和發酵溫度中，調理羊肉的感官評分和pH 值間差異均顯著（P ＜0.05），因此以這幾個因素為自變量，感官評分和pH 值為響應值，進行響應面優化試驗。

2.2 響應面優化試驗結果

2.2.1 響應面優化試驗結果及方差分析

在單因素試驗結果的基礎上，以菌種接種量（A）、大豆蛋白添加量（B）、發酵時間（C）和發酵溫度（D）為自變量，感官評分（Y1）和 pH 值（Y2）為響應值，按照Box-Behnken 中心組合設計原理，進行響應面試驗，因素與水平如表7所示。

表7 發酵條件優化響應面試驗因素與水平Table 7 Fermentation conditions optimization response surface test factors and levels

響應面試驗設計及數據結果如表8所示，對試驗數據進行方差分析，結果見表9和表10。

表8 響應面試驗設計及結果Table 8 Response surface test design and results

續表8 響應面試驗設計及結果Continue table 8 Response surface test design and results

表9 感官評分擬合二次多項式模型方差分析Table 9 Analysis of variance of sensory score fitting quadratic polynomial model

使用Design-Expert V 8.0.6 軟件對表8試驗數據進行多元回歸擬合，得到自變量（A、B、C、D）與感官評分（Y1）之間的二次多項式回歸模型方程為：

Y1=-149.120 00+17.993 33A+31.173 33B+3.428 33C+5.374 00D-0.400 00AB -0.162 50AC + 0.350 00AD +0.362 50BC+0.030 000BD-0.067 500CD-5.540 00A2-6.140 00B2-0.061 563C2-0.081 400D2

由表9方差分析可知，感官評分的模型確定系數R2=0.799 2，校正系數R2Adj=0.598 3，模型的P 值為0.007 2，說明模型極顯著，失擬項P 值為0.994 2＞0.05，影響不顯著，表明回歸方程與實測值之間擬合較好；一次項A，二次項B2、D2對感官評分的影響極顯著（P＜0.01），而一次項 D，二次項 A2的差異顯著（P＜0.05）。由表9中各因素的P 值可知，各因素對調理羊肉感官評分的影響大小依次為接種量（A）＞發酵時間（C）＞發酵溫度（D）＞大豆蛋白添加量（B）。

感官評分（Y1）擬合二次多項式模型的方差分析見表9。

自變量（A、B、C、D）與 pH 值（Y2）之間的二次多項式回歸模型方程為：

Y2=+3.546 00+0.960 33A+1.038 00B-0.060 583C+0.006 633 33D-0.110 00AB-0.033 750AC-0.003AD+0.00125BC-0.002BD+0.0035CD-0.049667A2-0.13467B2+0.000 552 083C2-0.000 896 667D2

pH 值（Y2）擬合二次多項式模型的方差分析見表10。

表10 pH 值擬合二次多項式模型方差分析Table 10 Variance analysis of pH fitting quadratic polynomial model

由表10方差分析可知，pH 值的模型確定系數R2=0.811 0，校正系數R2Adj=0.622 1，模型的P 值為0.005，說明模型極顯著，失擬項 P 值為 0.556＞0.05，影響不顯著，表明回歸方程與實測值之間擬合較好；一次項A 對感官評分的影響極顯著（P＜0.01），而交互作用項 AC、CD 的差異顯著（P＜0.05）。由表10中各因素的P 值可知，各因素對調理羊肉pH 值的影響大小依次為接種量（A）＞發酵溫度（D）＞大豆蛋白添加量（B）＞發酵時間（C）。

2.2.2 各因素間的交互作用分析

圖9中顯示了各因素之間的交互作用對調理羊肉感官評分的影響。

圖9 各因素之間的交互作用對調理羊肉感官評分影響的響應曲面和等高線Fig.9 Response surface and contour of the interaction between various factors on the sensory score of conditioning lamb

由圖9可知，接種量與大豆蛋白添加量、接種量與發酵時間、接種量與發酵溫度、大豆蛋白添加量與發酵時間、大豆蛋白添加量與發酵溫度、發酵時間與發酵溫度對調理羊肉感官評分的交互作用均不顯著。

圖10中顯示了各因素之間的交互作用對調理羊肉pH 值的影響。

由圖10可知，接種量與大豆蛋白添加量、接種量與發酵溫度、大豆蛋白添加量與發酵時間、大豆蛋白添加量與發酵溫度對調理羊肉pH 值的交互作用不顯著，而接種量與發酵時間、發酵時間與發酵溫度間的交互作用顯著。

綜合表8中的響應值Y1和Y2，通過Design-Expert V 8.0.6 軟件對方程進行求解，得到調理羊肉最佳發酵條件為：菌種接種量1.71%，大豆蛋白添加量3.11%，發酵時間19.98 h，發酵溫度30.09 ℃，此時的感官評分為30.01，pH 值為5.50。為了驗證最優發酵條件，考慮到實際操作的可行性，將優化所得最佳發酵條件修正為：菌種接種量1.7 %，大豆蛋白添加量3.0 %，發酵時間20 h，發酵溫度30 ℃。在上述確定的最優發酵條件下重復3 次驗證試驗，得到調理羊肉的感官評分為（30.35±0.69）分，pH 值為 5.46±0.05，與理論值接近，說明二次多項式模型擬合度較好。

圖10 各因素之間的交互作用對調理羊肉pH 值影響的響應面和等高線Fig.10 Response surface and contours of the interaction between various factors on the pH of conditioning lamb

3 結論

本試驗采用了具有除膻作用的菌株米根霉TZH3和米曲霉TZH4 對調理羊肉進行發酵，結合感官評分、pH 值、色差和蒸煮損失率探究了菌種接種量、大豆蛋白添加量、發酵時間和發酵溫度對冷凍調理羊肉的影響。在此基礎上利用響應面優化試驗進一步分析，以調理羊肉的感官評分和pH 值為響應值，得到加工調理羊肉的最佳工藝參數為：菌種接種量1.7%，大豆蛋白添加量3.0%，發酵時間20 h，發酵溫度30 ℃，此時調理羊肉的感官評分為（30.35±0.69）分，pH 為5.46±0.05，與理論值相近。當 pH 值在 5.15～5.55 之間，調理羊肉的感官評分較高，此時調理羊肉的香氣、滋味和口感等較為適宜。該條件下有利于米根霉和米曲霉的的生長繁殖和脂肪酶的產生，能對羊肉的風味起到改善的作用。同時在該酸性條件下，羊肉的咀嚼性和組織狀態得到提高，提升了羊肉對食用者的可接受性。