銀杏內酯B治療缺血性腦中風的神經保護作用及機制的研究

劉 佳 陳少壯* 馬 駿 葉巖榮 蔡定芳 符茂東 羅艾君 姜維文

（復旦大學附屬中山醫院廈門醫院，福建 廈門 510530）

缺血性腦中風（IBS）是以腦組織缺血缺氧損傷及相應神經功能病變體征為主要臨床表現的腦血管病，多年來臨床尚缺乏有效治療藥物[1]。且梗死位置及體積相似的患者長期預后的神經功能恢復卻并不一致，這提示神經功能恢復并非僅與灰質相關[2]。

白質由神經元軸突、髓磷脂蛋白及多種膠質細胞構成，IBS引起缺血缺氧損傷，繼發膠質細胞壞死、髓磷脂蛋白脫失降解，影響神經功能。損傷后，機體產生少突膠質細胞前體細胞（OPCs）遷移至脫髓鞘區域，促進髓鞘再生，但該修復能力有限[3]；而小膠質細胞作為中樞免疫細胞，可被激活成兩種表型：M1型釋放炎性因子，造成繼發性的白質損傷[4]；M2型可吞噬、清理壞死細胞碎片，釋放生長因子促進細胞再生和分化成熟[5-6]。

銀杏葉主要成分銀杏內酯B（GB）是活性最強的血小板活化因子（PAF）抑制劑，前人研究主要聚焦于抗炎作用：抗血栓形成[7]；抑制血管內皮細胞氧化應激損傷[8]；抑制急性腦缺血炎性反應，改善急性期神經功能[9]。而脊髓損傷模型中，PAF作為GB的靶點，可誘導原本向少突膠質細胞分化的前體膠質細胞向星性膠質細胞轉化[10]，引起反應性星形膠質細胞增生；而阻斷PAF及其下游通路后，可明顯縮小膠質瘢痕，并改善動物神經功能[11]。這提示GB可能參與了髓鞘修復過程，本文旨在從白質修復角度進一步驗證GB的神經保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組：清潔級成年雄性C57/BL6小鼠（上海斯萊克實驗動物公司），8～10周齡，24～28 g，隨機分為假手術組（sham組），對照組（MCAO+PBS，簡稱PBS組），實驗組（MCAO+GB，簡稱GB組）。1.2 成年小鼠大腦中動脈栓塞（MCAO）模型制備[7]：動物麻醉后切開頸部，頸外動脈處剪一小口，放入線栓（硅膠頭直徑0.22～0.23 cm），離斷頸外動脈，沿頸外動脈、頸內動脈進線栓直至大腦中動脈起始部，檢測腦血流確認中動脈血流下降至術前的80%以上，阻斷60 min，拔出線栓。

1.3 腦室立體定位植入注射套管和滲透壓泵：術前1 d，將膠囊式滲透壓微量注射泵（alzet?，容積100 μL，泵藥速率0.5 μL/h，持續給藥7 d） 裝入液體：PBS組為100 μL PBS溶液；GB組為GB濃度為5 ng/μL的100 μL PBS溶液。將微量注射套管（alzet?）與滲透壓泵組合。MCAO后1 d使用立體定位儀將微量注射套管垂直向下植入麻醉小鼠損傷對側腦室區（前囟后0.20 mm，右側旁開1.00 mm），后將與套管相連的膠囊式滲透壓泵埋藏于小鼠背部皮下，生物膠黏合套管與顱骨。為確保泵內藥物的完全注射，第9天行氣麻下滲透壓泵取出+導管封堵術。

1.4 行為學實驗：錯步實驗：計數小鼠在含有2 cm×2 cm小柵欄的不銹鋼架上右側肢體錯步率（錯步數/總步數×100%）。轉棒實驗：記錄小鼠轉棒儀器（5 min內加速到40轉/分后恒速運轉）上的運動時間。共3次，間隔15 min。

1.5 組織冰凍切片制備：麻醉小鼠后左心室依次灌注生理鹽水、4%PA液后取腦固定，6 h后依次移入梯度蔗糖磷酸緩沖液脫水。使用恒冷箱切片機做冠狀切片，厚度為25 μm，-20 ℃原位雜交保護液中保存。

1.6 免疫組織化學染色：PBS漂洗腦片；破膜劑孵育20 min；漂洗；含10%山羊血清的PBS孵育1 h封閉抗原；含1%山羊血清的PBST液中加入一抗，室溫中孵育1 h，4度冰箱過夜；漂洗；含1%山羊血清的PBST溶液中加入熒光標記的二抗，室溫孵育1 h；漂洗；貼片封片。1.7 數據統計和分析：使用SPSS 16.0軟件處理數據，以均數±標準誤（x-±s）表示。使用單因數方差分析差異，P＜0.05為顯著性臨界值。

2 結 果

2.1 MCAO后腦室注射GB可促進遠期神經功能恢復：將PBS組、GB組制作MCAO動物模型模擬缺血性腦中風，Sham租行假手術。前兩組術后第1天植入、第9天取出藥物滲透壓泵（方法見前文）。前期預試驗明確GB給藥濃度為5 ng/μL（見討論）。MCAO后第9天，隨機選取6只小鼠腦片，右側腦室背側胼胝體均可見針道穿透處，且腦室無明顯擴大（圖1A），提示定位準確，藥物能夠注射入腦室內；GB劑量可代謝，無交通性腦積水等并發癥。

造模前予行為學訓練，MCAO術后第3、5、7、14、21、28、35天行行為學測試。錯步實驗（圖1B），轉棒實驗（圖1C）提示：MCAO造成小鼠運動功能受損，后患肢的錯步率顯著增加，轉棒時間減少，均持續至術后35 d；而GB治療后，小鼠神經功能損傷顯著改善，在術后21天錯步率顯著降低（P＜0.01），轉棒時間延長，術后14 d時顯著高于PBS組（P＜0.01）。這提示GB能促進MCAO后遠期神經功能恢復。

2.2 GB能促進MCAO后梗死周邊白質修復：筆者從白質修復角度進行探討。MBP是成熟的髓鞘內表達的特異性蛋白，脫髓鞘病變中會脫失；SMI-32 是非磷酸化神經絲的特異性蛋白，髓鞘損傷后可暴露。MBP/SMI-32提示白質修復程度。選取MCAO后35 d的腦片，共同標記MBP與SMI-32，在周邊區皮層（CTX）、胼胝體（CC）、紋狀體（STR）區（圖2A、B）對MBP/SMI-32熒光強度比值進行統計（圖3C），提示：MCAO造成該比值降低，而GB治療后該值明顯增高（P＜0.05），證實GB能促進梗死周邊區白質髓鞘蛋白的修復。

綜上，GB能明顯改善MCAO引起的長期神經功能的缺損，而GB對髓鞘的修復作用參與了神經功能的恢復。

圖1 MCAO后腦室注射GB可改善遠期神經功能。（A）給藥套管定位示意圖。紅色星號指示套管穿透損傷區對側胼胝體，到達側腦室。（B）右后肢錯步率。（B） 轉棒持續時間。*P＜0.05，**P＜0.01，GB組&PBS組；# P＜0.05，##P＜0.01，PBS組&Sham組

圖2 GB治療能夠促進MCAO后35 d時周邊區皮層、胼胝體、紋狀體白質髓鞘蛋白的修復。*P＜0.05，GB組&PBS組；##P＜0.01，PBS組&Sham組

3 討 論

本研究側重探究MCAO后GB的神經保護作用及其白質修復機制。但GB在體給藥的藥代動力學及外周不良反應尚需進一步研究。GB濃度10 ng/μL腦室給藥至第9天，取腦切片發現腦室明顯擴大，提示高濃度性腦積水，濃度減為5 ng/μL后腦室形態正常，故采用該濃度進行研究。同時，PBS組錯步率緩慢下降，而GB治療組第14天時錯步率一過性升高（圖1B），這可能由于GB突然撤藥引起了“反跳現象”，提示GB最好緩慢停藥。而對于GB治療MCAO的給藥劑量、速度、濃度仍需進一步細致的研究。

其次，GB修復白質的機制尚需進一步研究。前人研究表明GB體外可促進小膠質細胞向M2型激活，而后者能吞噬脫髓鞘碎片，而前期離體實驗發現，M2型小膠質細胞與OGD損傷的OPCs共培養后，能夠促進OPCs分化成熟，提高MBP的表達[7,10]。這可能是GB白質修復的重要機制。

綜上，本研究從白質修復相關的神經保護角度出發，肯定了腦室給藥在缺血性腦中風后治療效果，同時發現腦室注射GB促進損傷后的白質修復，為缺血性腦中風臨床藥物治療提供了新思路，使GB受體相關信號通路成為介導白質修復的重要靶點，為今后腦損傷后白質修復作用及機制的研究提供了更廣闊的研究空間。