雞新城疫-禽流感（H9亞型）二聯(lián)滅活疫苗（La Sota株+HP株）的滅活試驗

陳慧婧 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司 福州 350014

新城疫（Newcastle disease，ND）又名亞洲雞瘟，是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起雞的一種以呼吸困難、黏膜及漿膜出血、高熱、下痢、神經(jīng)紊亂為特征的禽類高度接觸性急性傳染病[1]。禽流感 （Avian Influenza，AI）是由禽流感病毒引起雞、火雞、鴨、鵪鶉和鵝及水禽、野鳥等患病的傳染性疾病，禽流感又被稱為真性雞瘟或歐洲雞瘟[2-3]。新城疫和禽流感是危害養(yǎng)禽業(yè)的主要病毒性疫病，在規(guī)模雞場中常混合感染或繼發(fā)感染。免疫接種仍然是防控該病的主要措施，雞新城疫-禽流感 （H9亞型）二聯(lián)滅活疫苗得到了廣泛應用。作為滅活疫苗，滅活過程事關生物安全，滅活不徹底存在散毒的風險，但加入過量的滅活劑又會影響疫苗的免疫效果。本試驗通過對兩種抗原用不同濃度的甲醛滅活劑量和不同滅活時間，檢測滅活效果和血凝價變化，篩選出最適合的甲醛滅活濃度和滅活時間。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 新城疫病毒 （La Sota株） 抗原BS2016005批、禽流感病毒（H9亞型 HP株）抗原BS2016003批，由福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.2 試驗動物 非免雞胚，由揚州康威提供，福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司進行孵化至10日齡。

1.1.3 主要試劑 生理鹽水、青霉素鏈霉素溶液（1萬單位/mL）、1%雞紅細胞懸液為福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司配制；甲醛溶液為三明市三圓化學試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 滅活 用37%甲醛溶液滅活，按最終濃度分為①組0.1%甲醛溶液、②組0.2%甲醛溶液、③組0.4%甲醛溶液、④組0.8%甲醛溶液。分別取新城疫抗原和禽流感抗原，用滅菌的四層紗布過濾，去除尿囊液中的雜質(zhì)，將過濾后的抗原準確稱量后置于滅菌玻璃瓶內(nèi)。將滅活劑緩緩加入抗原中，邊加邊搖晃使其充分攪拌均勻。加完滅活劑后需用滅菌紗布蘸取滅活劑擦拭瓶口和瓶頸內(nèi)壁，避免瓶頸附近在抗原接觸不到滅活劑而導致滅活不徹底。充分混勻后置于37℃溫室中，期間每隔4 h搖勻一次，使其溫度均勻，滅活劑和抗原均勻接觸。待抗原達到37℃開始計時，分別在 10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h 取樣。

1.2.2 滅活效果評價

1.2.2.1 滅活檢驗

1.2.2.1.1 準備 1 mL注射器（帶5#針頭），標記好氣室及接種位的10日齡SPF雞胚12枚。

1.2.2.1.2 消毒 消毒SPF雞胚氣室及腔接種位，并在氣室及接種位上打孔。

1.2.2.1.3 接種 將待檢樣品接種SPF雞胚，每枚胚分別尿囊腔接種待檢滅活胚液0.2 mL，每個樣品接種12枚SPF雞胚。

1.2.2.1.4 照蛋 24 h后開始照蛋，每天照蛋2次，觀察5 d。

1.2.2.1.5 HA測定 對所有胚液分別測定紅細胞凝集價。

1.2.2.1.6 判定 雞胚非特異性死亡不應超過1枚，雞胚均無血凝出現(xiàn)，認為滅活完全。當HA結(jié)果有可疑時，應將可疑胚液按上述方法進行重檢，重檢不合格則說明滅活不徹底。

1.2.2.2 血凝價測定 取各甲醛濃度各滅活時間的樣品進行血凝價測定，同時留取新城疫病毒（La Sota株）抗原BS2016005批和禽流感病毒（H9亞型HP株）BS2016003批滅活前的樣品作對照。

3 結(jié)果與分析

3.1 滅活檢驗

3.1.1 新城疫病毒滅活檢驗結(jié)果 新城疫病毒經(jīng)不同濃度甲醛滅活不同時間的效果見表1。經(jīng)0.1%、0.2%甲醛溶液滅活16 h可以達到100%滅活效果，0.4%甲醛溶液滅活14 h達到100%滅活效果，0.8%甲醛溶液滅活10 h病毒全部死亡。從表1雞胚死亡比例可以看出，隨著甲醛濃度增加，病毒滅活速度加快。

表1 新城疫抗原滅活檢驗結(jié)果

3.1.2 禽流感病毒滅活檢驗結(jié)果 禽流感病毒經(jīng)不同濃度甲醛、滅活不同時間的效果見表2。經(jīng)0.1%、0.2%甲醛溶液滅活16 h可以達到100%滅活效果，0.4%甲醛溶液滅活14 h達到100%滅活效果，0.8%甲醛溶液滅活12 h達到100%滅活效果。從表2雞胚死亡比例可以看出，隨著甲醛濃度增加，病毒滅活速度加快，病毒全部滅活也隨著甲醛濃度增加而縮短時間。

表2 禽流感抗原滅活檢驗結(jié)果

3.2 不同濃度甲醛對血凝活性影響

3.2.1 不同濃度甲醛對新城疫病毒 （La Sota株）血凝活性影響 不同濃度的甲醛滅活新城疫病毒，滅活不同時間的血凝價見表3。由數(shù)據(jù)可以看出，新城疫病毒血凝活性受甲醛濃度和滅活時間影響較大，0.8%濃度的滅活影響最大，10 h時血凝價降低了6個滴度，到16 h時已經(jīng)沒有血凝活性；0.1%和0.2%相對接近，18 h前只降低了2個滴度，到48 h也降低了4～5個滴度，0.1%比0.2%稍好；0.4%到16 h已經(jīng)降低了4個滴度，到48 h只剩22。由此可見，新城疫病毒受甲醛濃度和滅活時間影響很大，濃度越大、時間越長，影響越大。

3.2.2 不同濃度甲醛對禽流感病毒 （H9亞型HP株）血凝活性影響 不同濃度的甲醛滅活禽流感病毒，滅活不同時間的血凝價見表4。由數(shù)據(jù)可以看出，禽流感抗原滅活前血凝是29，4組不同濃度及不同時間的血凝價全部是28。由此可見，禽流感病毒血凝活性受甲醛濃度和滅活時間的影響不大。

表3 甲醛對新城疫病毒血凝活性影響

表4 甲醛對禽流感病毒血凝活性影響

3 討 論

滅活工序是滅活疫苗生產(chǎn)中最重要、最關鍵的生產(chǎn)環(huán)節(jié)之一，抗原滅活的效果與滅活劑關系重大，如果滅活不徹底存在散毒的風險。甲醛是應用最廣泛的滅活劑，其普遍應用于動物滅活疫苗的生產(chǎn)中。甲醛的濃度、作用時間、溫度等條件是影響滅活效果和抗原損失的重要因素[4]。滅活疫苗生產(chǎn)中病毒滅活不徹底將造成災難性的影響，所以，在滅活時，有的會加入超量的滅活劑。田國斌等認為禽流感病毒在滅活時使用超量的甲醛溶液，病毒的保護性抗原會被破壞，對免疫效果會造成不良影響[5]。有關試驗證明疫苗中血凝素的含量與免疫后的抗體水平和攻毒保護率有密切關系。所以，本試驗對兩種抗原用不同濃度的甲醛和不同的時間進行滅活研究，觀察不同濃度甲醛對病毒的滅活效果以及對血凝活性的影響。

新城疫病毒經(jīng)0.1%和0.2%甲醛滅活16 h，病毒全部死亡；0.4%和0.8%甲醛分別在14 h和10 h病毒全部死亡。而新城疫病毒的血凝活性對甲醛比較敏感，0.8%甲醛濃度到16 h已經(jīng)沒有血凝價，0.4%濃度也使血凝價下降很多，到16 h已經(jīng)下降了4個滴度，到48 h只剩22，0.1%和0.2%甲醛濃度在18 h前血凝價只降低2個滴度，隨著時間延長到48 h也降低了4～5個滴度。田國斌等認為甲醛濃度的高低直接影響雞只接種部位的刺激和損傷大小，從而影響疫苗的吸收和免疫效果[5]。在保證病毒全部被滅活的前提下，選擇甲醛含量盡量低、血凝活性盡量高、滅活時間盡量短的條件。從試驗結(jié)果得出，新城疫病毒最適合的甲醛濃度為0.1%，滅活時間為16 h。

禽流感病毒經(jīng)0.1%和0.2%甲醛滅活16 h，病毒全部死亡；0.4%和0.8%甲醛分別在14 h和12 h病毒全部死亡。禽流感病毒的血凝活性受甲醛影響不大，滅活前血凝活性為29，而4個濃度的不同滅活時間，血凝活性全部為28，經(jīng)過滅活只下降了1個滴度。從試驗結(jié)果得出，禽流感病毒用0.1%甲醛濃度進行滅活16 h，病毒全部死亡，但是禽流感病毒很容易變異，為確保滅活效果，批量生產(chǎn)時可將禽流感病毒滅活時間定為18 h。