噬菌體展示隨機(jī)環(huán)八肽庫(kù)的構(gòu)建

葉長(zhǎng)爛,周 霞,謝浩然,馬金魁，張宏斌

(南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科,廣東廣州 510010)

噬菌體展示技術(shù) (PDT)于上世紀(jì)八十年代末提出并建立，以噬菌體或噬菌粒為載體，是重組蛋白、單鏈抗體、酶、脂蛋白及短肽的一種表達(dá)系統(tǒng)[1]。由此衍生的多種噬菌體展示文庫(kù)，已廣泛用于研究蛋白質(zhì)之間或蛋白與非蛋白、生物分子與其他物質(zhì)之間的相互作用，結(jié)合物或模擬表位篩選等[2-7]。然而，應(yīng)用噬菌體展示庫(kù)篩選獲得的靶分子結(jié)合物，其親和力等生物活性均較天然配體低。構(gòu)建并篩選次級(jí)噬菌體庫(kù)即突變庫(kù)是將初篩序列變?yōu)槔硐胄蛄械挠行緩街弧Ｍ蛔兾膸?kù)是對(duì)初次篩選所獲序列中的某些位點(diǎn)或片段(特異或隨機(jī)位點(diǎn))在DNA水平上進(jìn)行突變，再以噬菌體或噬菌粒為載體構(gòu)建次級(jí)文庫(kù)以獲得更高親和力的序列。多肽因具有易制備、便于改造、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，在藥物篩選和治療上的重要性越來越受到研究者的重視。多肽根據(jù)肽鍵的結(jié)構(gòu)分為直鏈肽和環(huán)肽，其中直鏈肽的研究最為廣泛和深入，常用的噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)中插入的基因經(jīng)噬菌體表達(dá)后往往也是以線性直鏈肽的形式展示在噬菌體表面，但直鏈肽進(jìn)入體內(nèi)后容易在各類酶的作用下發(fā)生快速降解，而經(jīng)過調(diào)整后的環(huán)肽在二硫鍵或其他結(jié)合鍵的作用下會(huì)形成固定構(gòu)象，不但代謝穩(wěn)定性和生物利用度會(huì)極大提高，而且更符合受體-配體(抗體-抗原)構(gòu)象的結(jié)合要求。

噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)因其構(gòu)建、改造及篩選的易操作優(yōu)勢(shì)使其最受關(guān)注。其中以隨機(jī)七肽、十二肽和環(huán)七肽庫(kù)的應(yīng)用最為廣泛[8-11]。隨機(jī)線性七肽、十二肽肽庫(kù)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，適合模擬表位的篩選。隨機(jī)環(huán)七肽庫(kù)，具有環(huán)行結(jié)構(gòu)可用于結(jié)合域篩選，但受到多樣性和環(huán)形結(jié)構(gòu)大小的限制，由于目標(biāo)結(jié)合域的不同，特別是尿酸和農(nóng)藥類分子，目前的商品化噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)無法滿足很多研究的需求。基于此原因，本研究構(gòu)建了噬菌體展示非天然隨機(jī)環(huán)八肽庫(kù)以滿足不同分子，特別是小分子結(jié)合物篩選的需要。

1 材料與方法

1.1 材料 Ph.D.Peptide Display Cloning System、大腸桿菌ER2738、EagⅠ-HF和KpnⅠ-HF限制性內(nèi)切酶為美國(guó)NEB公司產(chǎn)品；四環(huán)素為SIGMA公司產(chǎn)品；T4連接酶、質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物純化試劑盒、Taq DNA聚合酶等為德國(guó)QIAGEN公司產(chǎn)品；隨機(jī)八肽寡核苷酸引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成；其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 隨機(jī)八肽寡核苷酸引物的合成 編碼隨機(jī)八肽核苷酸片段的設(shè)計(jì)策略是采用(NNK)8編碼方式，其中編碼隨機(jī)八肽核苷酸序列中密碼子的前兩個(gè)核苷酸為任意核苷酸N(A 或 T or C 或 G)，最后一個(gè)核苷酸根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性設(shè)計(jì)為K(T 或 G)，K對(duì)應(yīng)的反義鏈配對(duì)核苷酸為M(A 或 C)。編碼正鏈序列：5′-GCT TGT (NNK)8 TGC GGT GGA GGT-3′；對(duì)應(yīng)肽鏈：Ala Cys (Xxx)8 Cys Gly Gly Gly。根據(jù)載體及EagⅠ和KpnⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)序列在引物中帶入相應(yīng)的核苷酸序列，延伸引物采用通用的序列。其中延伸引物序列(S)：5′-CAT GCC CGG GTA CCT TTC TAT TCT C-3′；編碼隨機(jī)八肽的寡核苷酸序列(AS)：3′-GG GCC CAT GGA AAG ATA AGA GTG AGA CGA ACA (NNM)8 ACG CCA CCT CCA AGC CGG CTT TGT AC-5′，其中陰影標(biāo)注堿基分別為KpnⅠ和EagⅠ酶切位點(diǎn)；測(cè)序引物序列：3′-GCA ATG CGA TTG ATA CTC CC-5′。

1.3 環(huán)八肽庫(kù)DNA片段的聚合和酶切 將5 μg合成的編碼環(huán)八肽庫(kù)的寡核苷酸模板與等摩爾的通用延伸引物在50 μL 含有100 mmol/L NaCl的Tris-EDTA緩沖液(TE)中混合，95 ℃水浴中熱變性1 min，水浴中自然降溫至37 ℃以下形成退火混合物，按反應(yīng)體系1：水119 μL、10×緩沖液2 20 μL、退火混合物50 μL、10 mmol/L dNTPs 8 μL、Klenow酶3 μL，總體積200 μL，混勻后瞬時(shí)離心，37 ℃ 10 min，65 ℃ 15 min延伸退火產(chǎn)物合成編碼環(huán)八肽庫(kù)的雙鏈DNA片段。隨后，將合成的雙鏈DNA按照反應(yīng)體系2進(jìn)行雙酶切：水154 μL、延伸合成的雙鏈DNA196 μL，10×緩沖液4 40 μL、10 U/μL 的EagⅠ-HF和KpnⅠ-HF限制性內(nèi)切酶各5 μL，總體積400 μL，混勻后瞬時(shí)離心，37 ℃ 5 h進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分離目的條帶，瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化酶切產(chǎn)物。

1.4 載體的酶切與純化 將10 μg載體M13KE加水至196 μL取代反應(yīng)體系2中的雙鏈DNA，按照反應(yīng)體系3進(jìn)行雙酶切:水144 μL、載體M13KE 196 μL，10×緩沖液4 40 μL、10 U/μL 的EagⅠ-HF和KpnⅠ-HF限制性內(nèi)切酶各10 μL，總體積400 μL，混勻后瞬時(shí)離心，37 ℃ 5 h進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分離目的條帶，瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化酶切產(chǎn)物。

1.5 甘油法感受態(tài)細(xì)胞的制備 挑ER2738新涂的四環(huán)素抗性平板(LB/Tet)單克隆接種于10 mL LB培養(yǎng)液中，37 ℃ 250 r/min搖床培養(yǎng)過夜，按1∶100的比例擴(kuò)大培養(yǎng)，37 ℃ 250 r/min搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(A6000.5～1.0)。冰浴30 min，4 ℃ 5 000×g離心15 min，棄上清，重懸于預(yù)冷的無菌水中，同樣離心棄上清，重復(fù)一次重懸于預(yù)冷的無菌水中離心棄上清。重懸于10%的預(yù)冷無菌甘油的水溶液中，4 ℃ 8 000×g離心10 min棄干凈上清，重懸于10% 冰預(yù)冷的甘油溶液。每管100 μL分裝，-80 ℃保存待用。

1.6 連接與轉(zhuǎn)化 雙酶切載體分別按摩爾比例1∶3、1∶5、1∶10與雙酶切的環(huán)八肽庫(kù)DNA片段進(jìn)行小量連接轉(zhuǎn)化。連接反應(yīng)按照反應(yīng)體系4:雙酶切載體M13KE 100 ng、雙酶切肽庫(kù)DNA (分別3、5、10 ng)、10×連接緩沖液 2 μL、T4連接酶1 μL、補(bǔ)加水至總體積20 μL，混勻后瞬時(shí)離心，16 ℃水浴中孵育過夜進(jìn)行連接。65 ℃ 15 min熱終止連接反應(yīng)。取各連接反應(yīng)產(chǎn)物各1、 2、3 μL分別加至100 μL分裝的電轉(zhuǎn)化細(xì)胞中電轉(zhuǎn)(Bio-Rad Gene-Pulser： 25 μF，200 Ω，2.5 kV)，立即各加入1 mL SOC培養(yǎng)液，37 ℃ 150 r/min搖床培養(yǎng)30 min。融化每管3 mL分裝的頂層瓊脂糖于45 ℃水浴中保溫，每管加入200 μL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ER2738菌作為測(cè)試管，分別按1∶10、1∶100、1∶1 000倍比稀釋電轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物，分別取10 μL各稀釋物加至的含頂層瓊脂糖和ER2738的測(cè)試管中，混勻后分別鋪于LB/IPTG/Xgal培養(yǎng)板，待頂層瓊脂糖凝固后，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。進(jìn)行藍(lán)斑計(jì)數(shù)計(jì)算滴度。根據(jù)結(jié)果，確定最佳連接比例為1∶5，連接產(chǎn)物用量2 μL。

1.7 隨機(jī)環(huán)八肽庫(kù)的構(gòu)建和鑒定 根據(jù)確定的最佳比例，2.5 μg雙酶切載體按照反應(yīng)體系4擴(kuò)大連接反應(yīng)，連接反應(yīng)后純化連接產(chǎn)物，分別取2 μL純化連接產(chǎn)物加至100 μL電轉(zhuǎn)化細(xì)胞中電轉(zhuǎn)，同時(shí)做25個(gè)電轉(zhuǎn)化，立即各加入1 mL SOC培養(yǎng)液，37 ℃ 150 r/min搖床培養(yǎng)30 min。合并各管，混勻留取20 μL進(jìn)行藍(lán)斑計(jì)數(shù)計(jì)算滴度，其余轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。從測(cè)滴度平板上隨機(jī)挑取40個(gè)單菌落，送測(cè)序公司測(cè)序，鑒定隨機(jī)環(huán)八肽庫(kù)的多樣性。

1.8 隨機(jī)環(huán)八肽庫(kù)的收獲 將電轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物按1∶50擴(kuò)大加至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期(A600<0.5)的ER2738菌中，37 ℃ 250 r/min搖床培養(yǎng)5 h。4 ℃ 5 000×g離心20 min收集上清，加入1/6體積的PEG/NaCl 4 ℃過夜沉淀噬菌體。4 ℃ 5 000×g離心20 min棄上清，沉淀重懸于Tris 鹽緩沖液(TBS)，4 ℃ 5 000×g離心10 min去除殘余細(xì)胞，上清加入1/6體積的PEG/NaCl 4 ℃沉淀噬菌體，同法離心棄上清，沉淀重懸于TBS，加入等體積無菌甘油-20 ℃長(zhǎng)期保存。

1.9 隨機(jī)環(huán)八肽庫(kù)庫(kù)容量的檢測(cè) 取2 μL收獲的隨機(jī)環(huán)八肽庫(kù)，按10倍比梯度稀釋，分別取105～109倍比稀釋物各10 μL加至45 ℃水浴中保溫的含頂層瓊脂糖和ER2738的測(cè)試管中，混勻后分別鋪于LB/IPTG/Xgal培養(yǎng)板，待頂層瓊脂糖凝固后，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。進(jìn)行藍(lán)斑計(jì)數(shù)，依據(jù)藍(lán)斑數(shù)和稀釋倍數(shù)計(jì)算庫(kù)容量。

2 結(jié) 果

2.1 肽庫(kù)的多樣性 肽庫(kù)的多樣性受插入目的序列的重組陽(yáng)性率和插入目的序列的不同率兩個(gè)因素的影響。選取40個(gè)重組克隆進(jìn)行序列測(cè)定分析，部分結(jié)果見圖1，其中重組陽(yáng)性率為92.5%(37/40)，除去3個(gè)為無正確片段插入；插入序列不同率達(dá)97.3%(36/37)，除去插入序列有1個(gè)為重復(fù)序列。重組陽(yáng)性克隆插入的核苷酸序列堿基數(shù)目及其對(duì)應(yīng)的氨基酸均正確，且編碼隨機(jī)八肽的DNA序列及對(duì)應(yīng)的氨基酸均互不相同，部分插入序列及對(duì)應(yīng)隨機(jī)八肽如下：GGG GCG GGT TCT TCG TAT CCG TAT(G A G S S Y P Y)；GGG ACT ACG TGG CTG TCT CCG AGT(G T T W L S P S)；CAG GTG CCG GCT CTG AAT CCG TCG(Q V P A L N P S)；ACG TTG GGT CAG ACG ATT CAT ATG(T L G Q T I H M)；TTG TTG CAT TCT AAT AAT CTG TCG(L L H S N N L S)；CGG CCT GAT CAT CCT AGT TTT TCT(R P D H P S F S)。堿基分布情況分析見表1，4種核苷酸的出現(xiàn)情況與預(yù)先設(shè)計(jì)的NNK模式相符，第一、 第二核苷酸分別為A/T/C/G中的任一種，其中每一種核苷酸和出現(xiàn)的頻率的理論值為25%，第三位核苷酸為G/T中的任一種，G或T的出現(xiàn)頻率為50%。由于樣本量的原因?qū)嶋H值與理論值不是完全一致。

2.2 庫(kù)容量 LB/IPTG/Xgal培養(yǎng)板進(jìn)行噬菌體滴度測(cè)量的原理是每個(gè)噬菌斑代表1個(gè)噬菌體，白斑代表是野生噬菌體，藍(lán)斑代表是重組噬菌體。依據(jù)庫(kù)容檢測(cè)平板上的藍(lán)色噬菌斑數(shù)約7.5×109(即庫(kù)容量)，結(jié)合重組的陽(yáng)性率92.5%和插入序列的不同率97.3%。參照計(jì)算公式：實(shí)際庫(kù)容量=平板總藍(lán)色噬菌斑數(shù)×重組陽(yáng)性率×序列的不同率，確定所構(gòu)建的隨機(jī)環(huán)八肽庫(kù)的庫(kù)容量，其實(shí)際庫(kù)容量(多樣性)為6.75×109克隆。結(jié)果表明，所構(gòu)建的噬菌體呈現(xiàn)隨機(jī)環(huán)八肽庫(kù)的框架結(jié)構(gòu)、庫(kù)容及多樣性符合設(shè)計(jì)要求。

圖1 肽庫(kù)挑克隆測(cè)序部分結(jié)果

編碼位置ATGC125.030.020.025.0222.522.525.030.030.052.547.50.0

3 討 論

多肽的長(zhǎng)短和構(gòu)象決定構(gòu)建的肽庫(kù)的應(yīng)用價(jià)值，曾有學(xué)者設(shè)想構(gòu)建15～100個(gè)氨基酸殘基片段的肽庫(kù)，以期肽鏈中自然形成含有天然表位中的一些二級(jí)結(jié)構(gòu)。但由于噬菌體展示肽庫(kù)的構(gòu)建過程中需要DNA轉(zhuǎn)化，目前最有效的電轉(zhuǎn)化率也很難超過1010，而且對(duì)于多樣性超過1012的肽庫(kù)，由于重復(fù)拷貝太低很難從中富集到需要的隨機(jī)肽段。因此，構(gòu)建噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)研究的重點(diǎn)從追求延長(zhǎng)氨基酸殘基片段的長(zhǎng)度逐步轉(zhuǎn)向了設(shè)計(jì)隨機(jī)氨基酸殘基序列，人為讓其形成具有二硫鍵的環(huán)狀結(jié)構(gòu)即噬菌體展示環(huán)肽庫(kù)。因此，噬菌體展示環(huán)肽庫(kù)的構(gòu)建及應(yīng)用也隨之更受研究者的偏重，而且噬菌體展示環(huán)肽庫(kù)在模擬物的篩選及在檢測(cè)和診斷方面的應(yīng)用已取得了很多進(jìn)展[12-15]。

目前應(yīng)用最廣泛的環(huán)肽庫(kù)是商品化的噬菌體展示環(huán)七肽庫(kù)，但由于受環(huán)狀結(jié)構(gòu)大小和庫(kù)容的限制不能滿足多種篩選的需要。本研究在前期商品化隨機(jī)七肽、十二肽和的環(huán)七肽庫(kù)篩選的基礎(chǔ)上，基于尿酸等小分子化合物的特點(diǎn)構(gòu)建了噬菌體展示隨機(jī)環(huán)八肽庫(kù)，增加了庫(kù)容的多樣性和肽環(huán)的大小。另外，本研究所選用的載體M13KE來源于M13mp19，僅包含一個(gè)gⅢ的單拷貝，更適合發(fā)現(xiàn)高親和力的配體。同時(shí)與以前所用的噬菌粒載體不同，其不需要抗菌藥物篩選和輔助噬菌體超感染。

本項(xiàng)目所構(gòu)建的噬菌體展示隨機(jī)環(huán)八肽庫(kù)和目前商品化肽庫(kù)具有不同的氨基酸序列和環(huán)狀結(jié)合域，不但可為尿酸等醫(yī)學(xué)相關(guān)小分子化合物的結(jié)合物篩選提供一種新的選擇，而且可能更適合某些分子的結(jié)合，這些將有望在相關(guān)分子的臨床檢測(cè)和治療研究中有所突破。同時(shí)，所構(gòu)建的噬菌體展示隨機(jī)環(huán)八肽庫(kù)可彌補(bǔ)目前商品化市場(chǎng)的不足，為今后開展肽庫(kù)的相關(guān)研究與應(yīng)用，特別是多肽類藥物和檢測(cè)試劑的篩選奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究針對(duì)小分子化合物的特點(diǎn)，采用人工合成的方法成功構(gòu)建了庫(kù)容量與多樣性都滿足篩選要求的噬菌體展示非天然隨機(jī)環(huán)八肽庫(kù)，并有望為多肽類制劑篩選的研究提供一種新的選擇。