合肥地區耐多藥結核分枝桿菌異煙肼、鏈霉素及乙胺丁醇耐藥相關基因位點表達研究

戚應杰,劉 婷,查曉丹,石玉如,王 云,岳 莉,馬筱玲

(中國科學技術大學附屬第一醫院/安徽省立醫院感染病院區檢驗科,安徽合肥 230000)

近年來，全球結核病的防控面臨嚴峻的考驗，尤其是耐多藥結核病(MDR-TB)的流行，MDR-TB定義為至少對利福平(RFP)和異煙肼(INH)耐藥。據2018年世界衛生組織(WHO)全球結核病報告估計[1]，目前全球MDR-TB 患者約有30 萬人,且MDR-TB的治愈率僅有55%，2017年約有18萬人死于MDR-TB。MDR-TB 的防控迫在眉睫。INH、鏈霉素(SM)、乙胺丁醇(EMB)是現階段治療結核病最為常用的一線藥物[2]。本文采用基因芯片法與測序法對101株耐多藥結核分枝桿菌三種常用一線藥物INH、SM、EMB的耐藥基因位點表達情況進行更進一步探究，為應用適合合肥地區甚至更大范圍快速檢測MDR-TB INH、SM、EMB的耐藥性提供更多的分子診斷數據。現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 101株耐多藥結核分枝桿菌均取自2013年1月至2017年12月在本院接受診治的結核病患者。結核分枝桿菌標準野生對照株為H37Rv(ATCC27294)由中國疾病預防控制中心傳染病控制所提供。

1.2 儀器與試劑 美國ABI公司ABI7300基因擴增儀；深圳亞能公司YN-H16分子雜交儀；操作按儀器說明書進行。結核耐藥突變檢測試劑盒購自深圳亞能生物技術有限公司； INH、 RFP、EMB、 SM藥敏培養基和菌種鑒別培養基購自珠海貝索生物技術公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離鑒定和體外藥物敏感試驗 分離到的陽性分枝桿菌菌株，采用WHO推薦的改良羅氏培養基比例法，培養2～3周，用含對硝基苯甲酸(PNBA) 和噻吩-2-羧酸肼(TCH) 的鑒別培養基進行菌種鑒定。各含藥培養基內的藥物臨界濃度分別為INH 0.2 mg/L，RFP 40 mg/L，SM 4 mg/L，EMB 2 mg/L。菌株在做藥物敏感性試驗的同時采用PNB/TCH進行菌群的初步鑒定，鑒別結核、非結核和牛分枝桿菌，見表1。

1.3.2 細菌基因組DNA提取 從改良L-J培養基斜面生長良好的耐多藥結核分枝桿菌刮取一菌環，溶于200 μL緩沖液(pH=8.0)中，經85 ℃水浴30 min滅活，取菌懸液20 μL加入20 μL M裂解液混勻，然后95 ℃沸水煮沸10 min，相對離心力(RCF)=6 285×g離心2 min，取上清液轉移至新管中即為DNA模版，-20 ℃保存。

表1 結核、非結核和牛分枝桿菌鑒定

1.3.3 耐多藥結核分枝桿菌基因聚合酶鏈反應(PCR)擴增 取4 μL DNA模版加入擴增管內，RCF=3 142 g離心2 s后放入PCR儀按程序擴增，擴增條件為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 45 s、54 ℃ 30 s、68 ℃ 60 s×40次，68 ℃延伸5 min。從http://ww.ncbi.nlm.nih.gov的Genbank中獲得結核分枝桿菌標準株H37Rv的katG、inhA、embB、rpsL、rrs基因序列[3]。采用primer premier 5.0設計引物，引物序列見表2。

表2 基因合成引物序列

1.3.4 基因芯片雜交、洗膜顯色與結果判斷 將PCR產物25 μL加入離心管中沸水煮10 min，放入已經預熱的雜交箱中于58.3 ℃雜交2 h，取出膜條洗滌15 min，最后將膜條浸泡在顯色液中避光顯色觀察結果，藍色為檢出該位點。該基因芯片法可檢測異煙肼耐藥相關突變位點：315M、-15M；鏈霉素耐藥相關突變位點：43M、88M；乙胺丁醇耐藥相關突變位點：306M1、306M2、306M3。

1.3.5 DNA序列分析 101株耐多藥菌株和部分正常樣本送往深圳亞能生物公司進行序列分析，以便于檢測DNA擴增的特異性和基因芯片雜交結果的準確性，同時便于挖掘新的耐藥基因突變位點。測序結果比對用GENUe軟件中的Align將測序結果與標準菌株H37Rv的基因序列進行比對[4]，確定基因突變位點。

1.4 統計學處理 采用數理統計軟件SPSS19.0對收集的數據進行整理與統計分析，率及構成比等計數資料的比較行χ2檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 101株MDR-TB的SM、EMB耐藥率 101例MDR-TB中對SM耐藥的70例，耐藥率69.3%；對EMB耐藥的52例，耐藥率51.4%；對SM和EMB二者均耐藥的45例，耐藥率44.5%。

2.2 基因芯片法檢測INH、SM及EMB基因突變位點分布情況 101例MDR-TB中基因芯片法檢出95例INH耐藥相關基因，其中74例katG基因315M位點突變，突變率為77.8%；85例inhA基因-15M位點突變，突變率為89.4%；72例315M與-15M位點共同突變，突變率為75.7%。檢出64例rpsL SM耐藥相關基因，其中57例43M位點突變，突變率為89.0%；7例88M位點突變，突變率為11.0%。檢出47例embB EMB耐藥相關基因，其中16例306M1位點突變，突變率為34.0%；32例306M2位點突變，突變率為68.0%；2例306M3位點突變，突變率為4.2%。

2.3 測序法檢測INH、SM及EMB基因突變位點分布情況 101例MDR-TB中測序法檢出98例INH耐藥相關基因突變，其中72例katG基因315位點突變，突變率為73.4%，2例katG基因463位點突變，突變率為2.0%；86例inhA基因-15位點突變，突變率為87.7%，1例inhA基因-8位點突變，突變率為1.1%，1例inhA基因-17位點突變，突變率為1.1%；10例oxyR-ahpC基因-12位點突變，突變率為10.2%,8例oxyR-ahpC基因-10位點突變，突變率為8.2%。檢出68例SM耐藥相關基因突變，其中59例rpsL基因43位點突變，突變率為86.8%；9例rpsL基因88位點突變，突變率為13.2%；4例rrs基因512位點突變，突變率為5.9%，6例rrs基因513位點突變，突變率為8.8%，6例rrs基因516位點突變，突變率為8.8%。檢出50例embB EMB耐藥相關基因，其中44例306位點突變，突變率為88.0%；2例406位點突變，突變率為4.0%。

3 討 論

隨著抗菌藥物大量應用使得結核病也出現了新的分型，MDR-TB便是其中之一。MDR-TB的出現不僅增加了結核病治療的難度，而且為患者的生命安全帶來了極大的威脅，MDR-TB控制的關鍵是早期選擇敏感藥物聯合治療[5]。INH、SM和EMB是抗結核治療的主要一線藥物，如何早期快速檢測其在MDR-TB中的耐藥性對MDR-TB的及時有效治療至關重要。目前的研究表明，結核分枝桿菌耐藥的主要機制是因為基因突變，結核分枝桿菌katG、inhA、embB、rpsL基因的點突變分別與結核分枝桿菌耐受INH、EMB和SM的藥物密切相關[6]。本研究采用比例藥敏法選取101株MDR-TB，發現SM耐藥率為69.3%，EMB耐藥率為51.4%，遠高于我國非MDR-TB的耐藥率[7]，這可能是這兩種藥物在臨床使用頻率過高有關。為進一步探究合肥地區MDR-TB的耐藥基因位點表達情況，同時挖掘有無新的基因型及突變位點，本研究采用PCR+反向點雜交(RDB)相結合的基因芯片技術和測序法檢測101株MDR-TB的INH、SM、EMB的耐藥基因位點表達情況。結果發現101例MDR-TB中基因芯片法和測序法分別檢出95例和98例INH耐藥相關基因突變，另外幾例沒有檢出耐藥相關基因位點突變，可能存在本研究之外的基因型及位點或其他耐藥機制，與INH耐藥的相關基因很多，最常見的有katG、inhA、ndh、oxyR-ahpC、kasA等[8]。本研究中katG基因315位點和inhA基因-15位點均具有較高的突變率，提示INH耐藥相關基因以katG基因315位點和inhA基因-15位點為主，與國內文獻報道一致[9-10]。測序法檢測結果提示還存在其他基因型及位點表達，本研究還檢測出2例katG基因463位點突變，1例inhA基因-8位點突變，1例inhA基因-17位點突變，特別是檢測出10例oxyR-ahpC基因-12位點突變，突變率為10.2%,8例oxyR-ahpC基因-10位點突變，突變率為8.2%。提示實驗室運用分子生物學手段進行INH耐藥基因位點檢測時應重視oxyR-ahpC基因及其位點突變的檢測。SM是氨基環醇糖苷類抗菌藥物，研究表明，編碼小亞基核糖體蛋白s12的rpsl和編碼16sRNA的rrs基因突變是MTB耐SM的主要分子機制[11]。本研究檢出SM耐藥相關基因rpsL，其常見突變位點為43和88，其中以43位點突變為主，突變率分別為89.0%(基因芯片法)和86.8%(測序法)；測序法同時又檢出4例rrs基因512位點突變，突變率為5.9%，6例rrs基因513位點突變，突變率為8.8%，6例rrs基因516位點突變，突變率為8.8%，說明rrs也是SM耐藥的一個常見耐藥相關基因，這與其他研究報道觀點一致[11]。本研究中約有5%SM耐藥株沒有檢出rpsl和rrs基因位點突變，是否存在其他耐藥機制或耐藥相關基因有待進一步研究。EMB是治療MDR-TB的重要藥物，本文中EMB的耐藥率高達51.4%，與國內有些研究報道一致[12-14]。EMB的耐藥機制研究顯示，結核分枝桿菌EMB耐藥性的產生主要與embCAB基因座突變有關，且以embB突變為主[15]，有研究報道在EMB耐藥菌株中embB306位點突變率約為68%[16]。本研究檢出embB306位點的突變率為88%，明顯高于其他研究報道的突變率，可能系研究的對象為耐多藥分枝桿菌有關[16]；測序法同時檢出2例embB406位點突變，提示embB406位點也可能是耐藥相關基因位點之一。

4 結 論

測序技術有助于從全基因組水平探討INH、SM及EMB的耐藥機制，耐多藥結核分枝桿菌INH、SM及EMB耐藥基因位點表達可作為臨床檢測耐藥性的有效依據；應當將INH耐藥相關oxyR-ahpC基因和SM耐藥相關rrs基因納入我國快速分子診斷產品中，以提高耐多藥結核分枝桿菌耐藥性檢測的敏感度。