大黃素對哮喘小鼠氣道重塑的干預效果及機制

袁曉芳 王宋平

(西南醫科大學附屬醫院呼吸一科，四川省瀘州市 646000,電子郵箱：840786087@qq.com)

哮喘是由包括嗜酸粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、平滑肌細胞、氣道上皮細胞等多種細胞及細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，病程的延長可導致一系列氣道結構的改變，即氣道重塑[1]。氣道炎癥和氣道重塑是哮喘的兩個重要特征。氣道重塑主要包括氣道管壁增厚、氣道上皮下纖維化、平滑肌細胞增生肥大、肌成纖維細胞增生以及腺上皮化生，其中以基底膜下Ⅰ型、Ⅲ型、V型膠原纖維和纖維連接素等細胞外基質(extracellular matrix，ECM)沉積增加，肌成纖維細胞活化及增殖為突出表現。哮喘患者體內轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)水平呈升高趨勢,在肺組織中許多細胞，如氣道上皮細胞、白細胞、嗜酸性粒細胞及T細胞等，均能產生TGF-β1,而TGF-β1在氣道上皮下纖維化及氣道平滑肌重塑中起著重要作用[2-4]。基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)和特異性內源性抑制因子之間的平衡在氣道壁基質沉積和結構重塑中發揮重要的作用，其可通過誘導細胞增殖分化，促進新生血管形成，刺激成纖維細胞的增生并合成膠原等多種機制引起氣道重塑[5]。

大黃素是中藥大黃的重要單體,具有抑菌、抗炎、保護肝腎、抑制血小板聚集、改善微循環、抗癌等作用，具有較好的臨床應用價值。近年來，研究顯示大黃素有降低TGF-β1及MMP-9的表達，以及減少膠原沉積的作用[6-8]。然而大黃素是否能通過影響支氣管肺組織中TGF-β1、MMP-9的表達，以及氣道膠原的沉積，從而抑制哮喘氣道重塑,目前國內外尚缺乏相關研究。本研究通過建立哮喘小鼠氣道重塑模型，觀察大黃素對哮喘氣道重塑的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選取清潔級雌性BALB/c小鼠32只(重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司，動物許可證號：21100230045566)，6～8周齡，體重(20±2)g。將小鼠標號，采用抽簽法隨機分為正常組(A組)、哮喘組(B組)、哮喘+小劑量大黃素組(C組)、哮喘+大劑量大黃素組(D組)，每組8只。

1.2 主要試劑及儀器 卵清蛋白(Sigma公司，批號：A8040)，大黃素(北京索萊寶科技有限公司，批號：E8390)，氫氧化鋁(上海源葉科技有限公司，批號：S30353)，兔抗鼠Ⅰ型、Ⅲ型膠原一抗(Abcam公司，批號：ab90395)，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔Ⅰ型、Ⅲ型膠原二抗(Aspen有限公司，批號：ab7778)，MMP-9酶聯免疫吸附劑測定試劑盒(優爾生公司，批號：SEA553Ra)，TGF-β1 引物(武漢金開瑞生物工程有限公司)，熒光定量PCR儀(Life Technologies公司，型號：StepOne)，酶標儀(DiaTek公司，型號：DR-200BS)，病理切片機(武漢恒意賽生物科技有限公司，型號：RM2016)，光學顯微鏡(Olympus公司，型號：CX31)，恒溫培養箱(上海精宏實驗設備有限公司，型號：GNP9160)。

1.3 哮喘氣道重塑模型制備及給藥方式 參照文獻[9]方法制造哮喘氣道重塑模型。B、C、D組小鼠自實驗室適應性喂養1周開始，第0、7、14天腹腔注射卵清蛋白致敏液200 μL(含100 μg卵清蛋白+2 mg氫氧化鋁)，第21天以卵清蛋白激發液(含50 μg卵清蛋白)滴鼻建立支氣管哮喘氣道重塑模型，50 μL/次，3次/周，連續6周。C、D組自第21天起分別給予40 mg/(kg·d)、80 mg/(kg·d)大黃素[10]灌胃，A、B組以等量生理鹽水灌胃，連續給藥6周。滴鼻與灌胃時間間隔無特殊要求。

1.4 肺組織標本收集 于末次激發后24 h內斷頸處死各組小鼠，將小鼠固定于手術板上，暴露胸腔，無菌條件下迅速取出左肺組織放于-80℃冰箱保存，備用于TGF-β1及MMP-9的檢測。無菌條件下取出右肺組織用4%多聚甲醛固定，備用于蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色、Masson染色、免疫組織化學檢測。

1.5 觀察指標

1.5.1 支氣管肺組織病理學改變：將部分支氣管肺組織脫水、包埋及切片，經蘇木素染細胞核、伊紅染細胞質及脫水封片后，在200倍光學顯微鏡下觀察支氣管肺組織病理學改變情況，觀察內容包括支氣管壁厚度、氣道上皮損傷程度、炎癥細胞浸潤程度。

1.5.2 氣道重塑指標：將部分支氣管肺組織脫水、包埋及切片，再將石蠟切片脫蠟至水，將肺組織經Masson染色后，在200倍光學顯微鏡下，每個標本隨機選取3個直徑在100～200 μm的完整支氣管橫截面，取其均值，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統測量支氣管基底膜周徑、支氣管總面積、支氣管管腔面積、平滑肌外緣內氣管面積、平滑肌內緣內氣管面積，同時用支氣管基底膜周徑將測量值標準化，標準化平滑肌厚度=(平滑肌外緣內氣管面積-平滑肌內緣內氣管面積)/支氣管基底膜周徑，標準化支氣管壁厚度=(支氣管總面積-支氣管管腔面積)/支氣管基底膜周徑。同時在200倍鏡下同一樣本隨機選取3個視野，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統測量膠原面積、整個圖像總面積，計算膠原面積比，膠原面積比=(膠原面積/整個圖像總面積)×100%。

1.5.3 肺組織Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量：取出右中葉肺組織后，脫水、包埋，將石蠟切片常規脫蠟后經乙二胺四乙酸緩沖液微波修復，經磷酸緩沖鹽溶液清洗(5 min/次，共3次)后放入3%過氧化氫溶液中，室溫下避光孵育，經磷酸緩沖鹽溶液清洗(5 min/次，共3次)后再用5%牛血清白蛋白封閉。去除牛血清白蛋白后，分別加入1 ∶150兔抗鼠Ⅰ型膠原一抗及1 ∶100的兔抗鼠Ⅲ型膠原一抗覆蓋組織，4℃過夜，經磷酸緩沖鹽溶液清洗(5 min/次，共3次)，再分別加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔Ⅰ型二抗及山羊抗兔Ⅲ型膠原二抗，37℃孵育50 min，去除磷酸緩沖鹽溶液后加入二氨基聯苯胺溶液，顯色并洗凈后用蘇木素復染，經梯度酒精脫水、二甲苯透明后，中性樹膠封固。用已知陽性切片作為陽性對照，用磷酸緩沖鹽溶液代替一抗作為陰性對照。用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統測定各組Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量，以積分光密度值表示。

1.5.4 肺組織TGF-β1 mRNA的表達：用無菌方法取約100 g肺組織，置于1 mL預冷的總RNA抽提試劑中充分研磨，加入三氯甲烷4℃ 10 000 g離心10 min，加入異丙醇再次于4℃ 10 000 g離心10 min，最后加入75%乙醇再次于4℃ 10 000 g離心10 min，待酒精完全揮發后提取肺組織RNA，在反轉錄酶作用下合成cDNA。小鼠TGF-β1上游引物為5′-GTGGCTGAACCAAGGAGACG-3′，下游引物為5′-AGGTGTTGAGCCCTTTCCAG-3′，擴增長度為195 bp；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)上游引物為 5′-CGCTAACATCAAATGGGGTG-3′，下游引物為5′-TTGCTGACAATCTTGAGGGAG-3′，擴增長度為201 bp。PCR反應體系包括2×實時熒光定量PCR反應混合物5 μL，引物工作液1 μL，模板液1 μL，蒸餾水2.8 μL，ROX參比液0.2 μL。PCR反應為95℃下預變性1 min，然后95℃變性15 s，退火溫度為58℃，20 s，72℃延伸45 s，共40個循環。其溶解曲線為60℃→95℃，每20 s升溫1℃。PCR結束后，采用2-△△Ct法計算目的基因相對表達量。

1.5.5 肺組織MMP-9含量：按照酶聯免疫吸附實驗試劑盒說明書操作，檢測小鼠肺組織MMP-9含量。

1.6 統計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠一般情況 建立支氣管哮喘氣道重塑模型后，A組小鼠活潑好動，毛發光滑，呼吸平穩；B組小鼠煩躁不安，頻繁打噴嚏，呼吸急促伴口唇發紺，部分小鼠出現小便失禁；C、D組小鼠均有打噴嚏、呼吸急促等狀況，但程度較B組小鼠輕。

2.2 各組小鼠支氣管肺組織病理學改變 A組小鼠支氣管管腔完整，內壁光滑，上皮未見明顯損害，管腔未見上皮細胞脫落，支氣管內未見炎癥細胞浸潤；B組小鼠支氣管管壁明顯增厚，黏膜上皮增生明顯，支氣管平滑肌層增厚，腔內可見黏液滲出，支氣管內炎癥細胞浸潤明顯；C組小鼠支氣管管腔內可見脫落上皮及少許滲出，管腔可見少量炎癥細胞浸潤；D組小鼠支氣管管腔可見少許脫落上皮及滲出，管腔炎癥細胞浸潤明顯減少。見圖1。

圖1 各組小鼠支氣管肺組織病理學改變(HE染色，×200)

2.3 各組標準化支氣管壁厚度及平滑肌厚度、膠原面積比比較 B、C、D組標準化支氣管壁厚度及平滑肌厚度、膠原面積比均厚于或大于A組，B組、C組、D組上述指標依次降低(均P<0.05)。見表1。

表1 各組標準化支氣管壁厚度及平滑肌厚度、膠原面積比比較(x±s)

注：▲實驗中死亡2只。與A組比較，△P<0.05；與B組比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

2.4 各組肺組織Ⅰ、Ⅲ型膠原含量的比較 Ⅰ、Ⅲ型膠原在4組肺組織中均有表達。B、C、D組Ⅰ、Ⅲ型膠原水平均較A組升高，B、C、D組上述指標依次降低(均P<0.05)。見表2。

表2 各組Ⅰ、Ⅲ型膠原含量的比較(x±s)

注：▲實驗中死亡2只。與A組比較，△P<0.05；與B組比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

2.5 各組肺組織TGF-β1 mRNA表達水平及MMP-9含量的比較 B、C、D組TGF-β1 mRNA相對表達水平、MMP-9含量均高于A組，B、C、D組上述指標依次降低(均P<0.05)。見表3。

表3 各組肺組織TGF-β1 mRNA表達水平及MMP-9含量的比較(x±s)

注：▲實驗中死亡2只。與A組比較，△P<0.05；與B組比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

3 討 論

哮喘是常見的慢性呼吸道疾病之一，其患病率在全球范圍內有逐年增加的趨勢[11]。氣道重塑是哮喘的重要特征，它包括杯狀細胞增生、上皮下膠原沉積、平滑肌增生肥大等。氣道重塑程度與哮喘的嚴重程度密切相關，且氣道重塑在哮喘的早期即已出現，并隨疾病進程呈進行政性加重；即使哮喘癥狀獲得短暫緩解，氣道重塑仍呈進行性加重，并伴有肺功能的下降，可發展為不可逆的氣道阻塞[12]。本研究結果顯示，經卵清蛋白致敏的B、C、D組哮喘小鼠標準化支氣管壁厚度及平滑肌厚度、氣道基底膜下膠原面積均增加(P<0.05)，提示3組小鼠均存在氣道重塑。

TGF-β具有調節細胞生長和分化的作用，是由巨噬細胞、上皮細胞、成纖維細胞、嗜酸性粒細胞產生的促纖維化細胞因子，與哮喘的發生、發展密切相關[13]。許多學者認為TGF-β1在過敏性氣道炎癥及氣道重塑中起著重要的主導作用，其不僅可以通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、P38、細胞外調節蛋白激酶、C-jun氨基末端激酶等通路的激活，誘導氣道平滑肌細胞的增殖和肥大，還可以通過誘導哮喘氣道上皮細胞上皮-間質轉化，導致成纖維細胞數量增加，并引起ECM的蛋白合成和分泌，從而參與氣道重塑[4，14]。本研究結果顯示，B、C、D組TGF-β1 mRNA相對表達水平高于A組(P<0.05)，與國內外研究結果相符，進一步說明TGF-β1參與氣道重塑。

MMP是由20多種高度保守的鋅、鈣離子依賴性蛋白內切酶所組成的蛋白，可降解ECM。MMP及其組織抑制劑之間的平衡在合成及降解氣道ECM中發揮重要作用。MMP-9作為MMP主要的存在形式，與哮喘有著密切聯系。研究表明，哮喘狀態下肺組織中MMP-9表達明顯升高，這可引起上皮成纖維細胞增殖、活化，以及大量膠原纖維增生，從而促進氣道重塑[15]。MMP-9不僅能引起膠原蛋白Ⅲ、膠原蛋白Ⅴ和肌腱蛋白沉積，還可降解ECM中的大部分成分如Ⅳ型膠原，并且通過釋放固定化生長因子來促進平滑肌增生，而增生的平滑肌細胞進一步釋放MMP-9，從而加重氣道重塑。除此之外，MMP-9還可以促使平滑肌細胞移行到血管基質，擴大血管的表面積，使血管壁變薄，促進新血管形成,從而參與氣道重塑中的血管重構[16]。本研究結果顯示，B、C、D組MMP-9含量高于A組(P<0.05)，提示MMP-9可能與氣道重塑密切關系。

大黃素為中藥大黃、百合等的活性成分，是單蒽核類1,6,8-三羥基蒽醌衍生物。近年來，有研究發現大黃素不僅能降低哮喘氣道炎癥，其對肺纖維化及慢性胰腺纖維化也有緩解作用[6，17]。本研究結果顯示,B、C、D組標準化支氣管壁厚度及平滑肌厚度、氣道基底膜下膠原面積比、TGF-β1 mRNA相對表達水平依次減小或降低(均P<0.05)，提示大黃素可能是通過降低TGF-β1 mRNA表達從而改善哮喘小鼠氣道重塑，且大劑量的大黃素對氣道重塑的抑制作用更明顯。國內外研究也證實大黃素極可能通過Smad 2/3/7通路負性調節TGF-β1的表達而改善氣道重塑[18-19]。本研究結果還顯示，B、C、D組肺組織中MMP-9及Ⅰ、Ⅲ型膠原含量依次降低(均P<0.05)，提示大黃素還可能通過降低MMP-9及Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量，從而減輕氣道重塑，且大劑量的大黃素的作用更明顯。其可能是通過抑制MAPK激酶的激酶-MAPK激酶-MAPK信號通路，降低核轉錄因子-κB活化，以及抑制p38-MAPK和Janus激酶-信號傳導子與轉錄激活子信號通路的激活，從而改善氣道重塑[19-22]。

綜上所述，大黃素可改善哮喘小鼠氣道重塑，且大劑量的抑制作用更明顯；其機制可能與大黃素抑制TGF-β1 mRNA、MMP-9、氣道壁Ⅰ型及Ⅲ型膠原的表達有關。