HPLC法同時測定復方阿膠補血顆粒中4種氨基酸

尹寧寧，郭東曉

(1．山東省食品藥品審評認證中心，山東濟南250014;2．山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南250101)

復方阿膠補血顆粒由阿膠、熟地黃和黨參3味藥組成，具有補氣養血的功效，用于氣血兩虛所致的倦怠乏力、面色無華、頭暈目眩、失眠多夢、心悸氣短等癥，以及缺鐵性貧血見上述證候者。復方阿膠補血顆粒是湖南東健藥業有限公司獨家生產品種，最早收載于《安徽省藥品標準》(1987年)，原名“阿膠沖劑”。1992年5月14日湖南省藥政局批準生產。2002年11月30日地標升國標，由原國家食品藥品監督管理局批準為“復方阿膠補血顆粒”，收載于《國家中成藥標準匯編》內科氣血津液分冊，標準號為WS-10319(ZD-0319)-2002。該標準含量測定項下僅收載總氮量的測定，方法專屬性較差。參照《中國藥典》2015年版阿膠含量測定項下［1］以及相關文獻［2-10］，本文研究建立了處方藥味阿膠中L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸的HPLC含量測定方法，提高了含量測定方法的專屬性。

1 儀器與試藥

Agilent1200高效液相色譜儀;MettlerAE240電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司);L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸對照品，購自中國食品藥品檢定研究院，批號分別為111578-200201、140689-200401、140680-200401、140677-200405;乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。復方阿膠補血顆粒收集自湖南東健藥業有限公司，規格為每袋裝20g，批號分別為 20090101、20090103、20090701。

2 方法與結果

2．1 溶液的制備

2．1．1 混合對照品溶液的制備 精密稱取L-羥脯氨酸對照品 9．73mg、甘氨酸對照品 18．14mg、丙氨酸對照品 8．12mg、L-脯氨酸對照品 13．31mg，加 0．1 mol·L-1鹽酸溶液使溶解并定容至50mL。精密量取 3mL，置 10mL 量瓶中，加 0．1mol·L-1鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得混合對照品溶液，每1 mL 含 L-羥脯氨酸 58．38 μg、甘氨酸 108．84 μg、丙氨酸 48．72 μg、L-脯氨酸 79．86 μg。

2．1．2 供試品溶液的制備 取裝量差異項下的本品，研細，取約2．5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入0．1mol·L-1鹽酸溶液 20mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率500W，頻率40kHz)30min，放冷，再稱定重量，加0．1mol·L-1鹽酸溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續濾液2mL，置5mL安瓿中，加鹽酸2mL，150℃水解1h，放冷，移至蒸發皿中，用水10mL分次洗滌，洗液并入蒸發皿中，蒸干，殘渣加 0．1mol·L-1鹽酸溶液溶解，濾過，濾液轉移至25mL量瓶中，加0．1mol·L-1鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2．1．3 陰性對照溶液的制備 取處方中除阿膠以外的其他藥味，照處方的組成和比例制成不加阿膠的陰性對照樣品，并按“2．1．2”項下方法制成陰性對照溶液。

2．1．4 衍生化溶液的制備 精密量取上述混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各5mL，分別置25mL量瓶中，各加0．1mol·L-1異硫氰酸苯酯(PITC)的乙腈溶液 2．5mL，1mol·L-1三乙胺的乙腈溶液2．5mL，搖勻，室溫放置1h后，加50%乙腈至刻度，搖勻。取10mL，加正己烷10mL，振搖，放置10min，取下層溶液，濾過，取續濾液，即得。

2．2 色譜條件及系統適用性試驗 WatersSunfire C18色譜柱(4．6mm×250mm，5 μm);以乙腈-0．1 mol·L-1醋酸鈉溶液(用36%乙酸調節pH值至6．5)(7∶93)為流動相A，以乙腈-水(4∶1)為流動相B，梯度洗脫(0～13min，100%A →93%A;13～17．9 min，93%A →88%A;17．9～29min，88%A →85%A;29～39min，85%A →66%A;39～45min，66%A →0%A);流速 1．0mL·min-1;測定波長 254nm;柱溫 43℃;分別吸取“2．1．4”項下各溶液的衍生化溶液，進樣量5μL。在上述條件下，4種氨基酸的色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1．5，理論板數均大于6000。樣品中其他成分對4種目標成分的測定沒有干擾，色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2．3 含量測定方法學驗證

2．3．1 線性關系考察 精密吸取“2．1．4”項下混合對照品溶液的衍生化溶液各 1、2、3、4、5、10 μL，按“2．2”項下色譜條件進行測定，以各成分進樣量X(μg)為橫坐標，峰面積Y為縱坐標進行線性回歸。結果在相應進樣量范圍內，4種成分線性關系良好，結果見表1。

2．3．2 精密度試驗 精密吸取“2．1．4”項下混合對照品溶液的衍生化溶液5μL，注入液相色譜儀，連續進樣6次，結果L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸峰面積的 RSD 分別為0．4%、0．4%、0．5%、0．4%。結果表明儀器的精密度良好。

2．3．3 穩定性試驗 取“2．1．4”項下復方阿膠補血顆粒供試品溶液(批號：20090103)的衍生化溶液分別于 0、2、4、6、8、12h 分別進樣 5 μL，結果 L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸峰面積的RSD分別為 0．7%、0．4%、0．4%、0．6%。表明供試品溶液中的4個待測成分在室溫放置12h內穩定性良好，能夠滿足測定需要。

2．3．4 重復性試驗 取復方阿膠補血顆粒樣品(批號：20090103，平均裝量 20．2307g)，按照“2．1．2”項下方法，平行制備 6份供試品溶液，然后按照“2．1．4”項下方法，分別制備上述供試品溶液的衍生化溶液，進樣5μL進行測定。結果L-羥脯氨酸平均含量為 143．5mg/袋，RSD 為 0．7%;甘氨酸平均含量為 279．8mg/袋，RSD 為 1．9%;丙氨酸平均含量為109．0mg/袋，RSD 為 1．7%;L-脯氨酸平均含量為172．0mg/袋，RSD 為 1．0%。結果表明該測定方法的重復性良好。

2．3．5 加樣回收率試驗 取“2．3．4”項下已測定含量的復方阿膠補血顆粒(批號：20090103)粉末約1．25g，共取6份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸對照品適量，按照“2．1．2”項下方法自“精密加入 0．1 mol·L-1鹽酸溶液20mL”起，同法制備供試品溶液，然后按照“2．1．4”項下方法，分別制備上述供試品溶液的衍生化溶液，進樣5μL進行測定，并計算4種待測成分的加樣回收率，結果見表2。試驗結果表明，含量測定方法回收率良好。

2．4 樣品測定 取收集到的3批復方阿膠補血顆粒樣品，按照“2．1．2”項下方法制備供試品溶液，然后按照“2．1．4”項下方法，分別制備上述供試品溶液的衍生化溶液，進樣5μL進行測定。結果見表3。

表3 3批復方阿膠補血顆粒中4種氨基酸的測定結果

3 討論

3．1 色譜柱的考察 對3個品牌的色譜柱進行考察，包括 WatersSunfireC18、迪馬 KromasilC18、InertsilODS-3C18(均為4．6mm×250mm，5 μm)，結果對照品溶液和供試品溶液的衍生化溶液色譜圖中，4種氨基酸色譜峰均有良好的對稱因子、理論板數及分離度，表明該方法對色譜柱無選擇性，適用范圍廣。

3．2 取樣量的考察 分別取 2．0、2．5、3．0g 樣品，精密稱定，按照“2．1．2”項下方法制備供試品溶液，然后按照“2．1．4”項下方法，制備供試品溶液的衍生化溶液，進樣測定。3種取樣量的測定結果沒有顯著差異，但取樣量為3．0g時，L-羥脯氨酸的峰形較差，為了確保分離效果，同時考慮到取樣的均勻性，選擇取樣量為 2．5g。

3．3 檢測結果的分析 《中國藥典》2015年版阿膠藥材含量測定項下，規定L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸不得少于 8．0%、18．0%、7．0%、10．0%［1］。根據復方阿膠補血顆粒中阿膠的處方量(50g)、制劑的制成總量(1000g)、規格(每袋裝20g)進行折算，L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸的理論含量分別為不得少于 80．0、180．0、70．0、100．0mg。按轉移率為90%進行折算，建議規定本品含量限度為每袋含阿膠以L-羥脯氨酸計，不得少于72．0mg;以甘氨酸計，不得少于 162．0mg;以丙氨酸計，不得少于 63．0 mg;以L-脯氨酸計，不得少于90．0mg。收集的3批樣品均符合上述規定。