基于二代測序的肺癌患者外周血ctDNA突變與臨床病理特征的相關性研究

劉苗苗 南巖東 房延鳳 姜華

空軍軍醫大學唐都醫院呼吸與危重癥醫學科,西安 710038

肺癌目前為全球癌癥死亡的最常見原因,每年超過100萬人死于該癌癥,其發病率及致死率仍呈上升趨勢[1-2]。非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer,NSCLC)約占肺癌發病總數的80%～85%,臨床上以手術、化放療等綜合治療為主,一定程度上改善了患者的生存及預后。但在實際臨床診療中,75%肺癌患者一旦確診均為中晚期,治療效果并不理想。整體來說患者的5年生存率僅僅約為13%,給個人家庭和社會帶來沉重負擔。隨著研究的不斷深入,分子檢測尤其是基因檢測在NSCLC中的診療價值逐漸凸顯,成為學者們的研究熱點。

傳統基因檢測技術包括突變阻滯擴增系統PCR、高效液相色譜、Sanger測序等。其主要針對特定的某個基因進行檢測,但不能深入研究基因組數量及種類的變化,且對癌組織與血液樣本的提取與保存標準較高[3-4]。而二代測序 (next generation sequencing,NGS)具有高通量,能夠在單個組織或血液樣本中同時檢測出大部分基因組的改變,聯合臨床病理特征對肺癌的診斷、靶向治療與預后進行持續性監測,并且對發現某些潛在的或稀有的突變位點有一定臨床應用價值[5-6]。

在臨床診斷過程中,基于組織的基因檢測仍然是金標準。但在實際臨床工作中,腫瘤組織樣本獲取風險高、重復活檢較難和腫瘤異質性等給組織樣本獲取提出了難題。體液檢測較組織活檢具有無侵襲性、風險低、取材方便等優勢,主要包括血液、痰液、尿液等體液中的循環腫瘤DNA (cell-free DNA,ctDNA)、循環游離DNA (circulating cellfree DNA,cf DNA)、循壞腫瘤細胞 (circulating tumor cell,CTC)與外泌體。ct DNA 可在組織樣本難以獲取時作為合適的替代選擇,為肺癌的診斷、治療及病情監測提供更加全面的基因概括。本研究收集肺癌患者血液樣本基于NGS技術進行表皮生長因子受體 (epidermal growth factor receptor,EGFR)、鼠類肉瘤病毒癌基因 (kirsten rat sarcoma viral oncogene,KRAS)、人 第 10 號染色體缺失的磷酸酶 (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)、MNNG HOS轉化基因(MNNG HOS transforming gene,MET)、磷脂酰肌醇激酶催化亞基α多肽基因(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphonate 3-kinase,catalytic subunit,alpha polypeptide gene；PIK3CA)及人抑癌基因TP53 (TP53)基因檢測,旨在探討肺癌患者血液ctDNA 檢測上述基因突變與臨床病理特征之間的相關性,分析影響各個基因發生突變的危險因素以及相互之間的關系,為臨床個體化治療提供指導。

1 對象與方法

1.1 研究對象 前瞻性納入2017年12月至2018年7月就診于空軍軍醫大學唐都醫院呼吸與危重癥醫學科194例肺癌患者,年齡 (59.34±9.63)歲,年齡范圍為33～81歲；男133例,女61例；有吸煙史106例,無吸煙史88例；病理類型中,腺癌90例,鱗癌56例,小細胞癌48例；分化程度中低、中和高分化例數分別為132、57和5例；臨床分期中Ⅰ～Ⅳ期例數分別為13、24、57和100例；轉移患者163 例,未轉移患者31 例。入組標準：(1)經組織學或病理學診斷為肺癌的患者；(2)所有受試者均為首診或既往3 個月前接受過治療；(3)臨床病例資料完善； (4)所有受試者知情同意。排除標準：(1)肝腎功能異常；(2)合并其他系統原發性惡性腫瘤或器官功能障礙性疾病；(3)病理診斷不明確；(4)臨床資料不完整；(5)不愿意配合者。記錄并分析肺癌患者的臨床病理特征,主要包括：年齡、性別、吸煙史、腫瘤病理類型、分化程度、轉移、臨床分期的臨床資料。臨床分期嚴格按照國際抗癌聯盟第八版肺癌TNM 分期標準執行[7]。本研究通過空軍軍醫大學唐都醫院醫學倫理委員會批準 (第K201709-01號)。

1.2 樣本收集 肺癌患者均采集空腹靜脈血10 ml于2個5 ml EDTA 抗凝管中,將EDTA 抗凝管置于4 ℃、離心半徑300 mm、6 000 r/min 離心機(型號：LX-300,中國江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)中離心10 min,在操作臺內提取上清液分別平均置于3個2 ml離心管內；將3個2 ml離心管置于4 ℃、離心半徑300 mm、16 000 r/min離心機中離心10 min,在操作臺內提取上清液于2個2 ml凍存管 (Corning430659 2.0 ml外旋凍存管)中,上清液總體積不低于3 ml,用自封膜將凍存管口進行密封,儲存于-80 ℃低溫冰箱內。所有過程在2 h內完成。所有樣本干冰運輸至上海真固生物科技有限公司實驗室,用血液DNA 提取分離試劑盒 (批號：55114,荷蘭控股QIAGEN 有限責任公司)完成ct DNA 的提取,7 d內完成檢測。

1.3 DNA 的提取與定量ct DNA 提取 依據QIAGEN QIAamp 循環核酸試劑盒 (批號：51304,荷蘭控股QIAGEN 有限責任公司)操作手冊提取,提取好的ctDNA 含量采用Qubit?3.0熒光定量儀和Qubit雙鏈DNA 高敏感度檢測試劑盒(批號：Qubit?3.0,美國Invitrogen公司)測定,定量方法依據Qubit?3.0操作說明。

1.4 文庫構建及測序 采用Qubit?3.0熒光定量儀和Qubit雙鏈DNA 高敏感度檢測試劑盒測定,定量方法依據Qubit?3.0操作說明。采用Miseq測序儀對構建的DNA 文庫進行測序,操作流程依照MiSeq的文庫和測序準備及MiSeq系統使用手冊,測序讀長為PE50。

1.5 統計學分析 基于云端自主開發的分析流程(真固數據分析流程)得出相應的檢測結果。采用SPSS 19.0軟件進行數據分析,計數資料用例數表示,采用χ2檢驗進行組間比較,spearman相關分析基因之間的相關性。對單因素分析結果中有統計學意義的指標采用二 (多)元logistic回歸分析行危險因素分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EGFR、KRAS基因突變與臨床病理特征之間的相關性 EGFR 基因突變在性別、吸煙史方面差異有統計學意義,尤其在女性 (P=0.007)、不吸煙 (P=0.034)的肺癌患者中EGFR 基因突變顯著升高；KRAS 基因突變與轉移顯著相關(P=0.029),轉移者KRAS基因突變較非轉移者突變多。PTEN、MET 及PIK3CA 基因突變在年齡、性別、吸煙史、病理類型、分化程度、臨床分期、轉移之間均無相關性 (P值均＞0.05)。TP53基因突變與病理類型間顯著相關 (P=0.001),其中小細胞癌較腺癌與鱗癌TP53突變發生較高,與其他臨床病理特征之間均無相關性(P值均＞0.05)。見表1。

2.2 EGFR、KRAS及TP53基因突變與性別、吸煙史、轉移之間的二 (多)元Logistic回歸分析 性別 (OR=2.406,95%CI：1.268～4.565,P=0.007)與吸煙史 (OR=0.516,95%CI：0.279～0.956,P=0.035)是EGFR 突變的危險因素 (表2)；腺癌(OR=0.244,95%CI：0.112 ～0.529,P=0.000)和鱗癌(OR=0.333,95%CI：0.144～0.770,P=0.010)是TP53突變的危險因素 (表3)。

2.3 EGFR、KRAS、PTEN、MET、PIK3CA、TP53基因之間的相關性 EGFR 與PIK3CA 之間具有相關性 (r=0.201,P=0.005),與PTEN、MET、TP53之間均無相關性 (r=0.118、-0.102、0.088、0.107,P=0.101、0.157、0.225、0.138)；KRAS與PTEN、MET、PIK3CA、TP53之間均顯著相關 (r=0.224、0.221、0.242、0.144,P=0.002、0.002、0.001、0.045)；PTEN 與 MET、PIK3CA、TP53 之間均無相關性 (r=0.089、-0.012、-0.094,P=0.218、0.866、0.194)；MET與PIK3CA有相關性 (r=0.192,P=0.007),但與TP53之間無相關性 (r=0.084,P=0.246)；PIK3CA 與TP53之間無相關性 (r=0.128,P=0.075)。

)(例系關的間之征特理病床臨與變突因53基TP CA 及T、PI K3 N、ME、P TE R、KR AS GF 1 E表P 值.672值53χ20.180 0 TP性陰45性陽53 P 值.727值CA K3χ20.122 0 PI 性陰83性陽15 P 值.589值T ME χ20.293 0性陰90性陽8 P 值值7 0.472 EN χ20.51 PT 性陰88性陽10 P 值.865值AS χ20.029 0 KR性陰86性陽12 P 值81.1值FR χ21.793 0 EG性陰72性陽26數例98標指 ）床 （歲臨 齡 ≥60年47 49 83 13 86 10 83 13 85 11 62 34 96＜60.207人為1.590 0.512 0.429 00.001.626.415.783 3.699；T 0.936 0 2.854 0 0.076 0 P5 13基亞593348445228122306091226457814 α基亞化742858443828363277241231558517催酶激.723醇0.125 0.485 0.487 0.438 1.650 0.353 2.081 0.366 3.172 0.769 0.086 0肌酰脂磷A 為113538977804739551 11012234784 14026；PIK 3C 208171110990622111016235因基化.376轉S 0.783 0.563 0.335 0.944 0.115 0.583 1.080 0.747 1.227 0.448 0.576 0HO NG MN 119579581815144453 11911215391 14927；M ET 為14411795414132349144酶酸.713磷的3 0.485.332.218.447.310失0.159 0 0.488 0 2.208 0 3.043 0 2.661 0 1.03缺體色染8 11 5395767651444470 12112253852 1429 10號158111214541101222415212第人.912N 為0.012 0.485 0.489 0.423 1.720 0.637 0.901 0.255 4.062 0.009 6.847 0；P TE因基癌毒117549576785241551 11513235085 14031病瘤肉16711121247061701715230類鼠為07S.03481896848 7.406 0.0 4.480 0.0 5.019 0.4 1.431 0.1 5.052 0.1 2.093 0；K RA體受子0 10 3480545543363438992140646 1118因長生33272634351312214434317364713皮表13361 10688905648557 132132457 100 16331R 為53癌TP GF型胞 度 化 化 化 期 ：E 因史類癌癌細程分分分分期期期期 注基別男女煙有無理腺鱗小化高中低床ⅠⅡⅢⅣ 移是否 癌性吸病分臨轉抑

3 討論

個體化精準治療死亡概念在肺癌治療領域效果顯著,此前需檢測相應的突變基因進而選擇最佳靶向藥物[8-9]。考慮到肺癌患者外周血中的ct DNA 來源于腫瘤組織,其包含了腫瘤組織的全部遺傳信息,因此獲取血液樣本便克服了取材大小、腫瘤生長部位、腫瘤異質性等因素的干擾,提高了肺癌的陽性診斷率。NGS技術較傳統檢測手段具有單次高通量檢測體內多個基因的狀態及變化情況,豐富了臨床上對肺癌患者的診斷、治療及疾病預后持續性監測[10-11]。通過檢測外周血中ctDNA 的變化情況,可以動態監測疾病的變化情況并且制定最精準的治療方案。隨著NGS 技術不斷快速地發展,ct DNA 的檢測在肺癌中的應用愈加重要[12-13]。本研究旨在探討肺癌患者血液中EGFR、KRAS、PTEN、MET、PIK3CA、TP53 基因與臨床病理特征之間的相關性,進一步分析肺癌患者基因突變的危險因素以及各個基因之間的關系,指導臨床個體化治療。

本研究顯示EGFR 在不吸煙的女性肺癌患者中的突變率顯著升高,和既往研究結果一致[14-15]；KRAS基因突變與轉移相關,轉移者KRAS 基因突變較多,提示KRAS基因突變在臨床分期較晚時被檢測,意味著KRAS陽性突變者的治療效果及預后較差。既往研究表明KRAS在EGFR 信號傳導通路中具有重要作用,位于通路下游,一旦KRAS持續活化,多種腫瘤增殖及分裂因子將被持續地激活,使針對EGFR 的靶向藥物療效降低,甚至耐藥[16-17]。PTEN、MET、PIK3CA 基因突變在年齡、性別、吸煙史、病理類型、分化程度、臨床分期、轉移方面差異均無統計學意義,提示3種基因在肺癌的一般臨床特征中無明顯差異,表明上述基因的檢測不易受臨床基線資料影響。TP53基因突變與病理類型顯著相關,其中小細胞癌較腺癌與鱗癌TP53突變發生較高,并且差異具有顯著的統計學意義,提示TP53基因可作為小細胞肺癌的輔助診斷指標。Mounawar等[18]總結了116 例腫瘤患者的研究,表明TP53頻繁突變預示了預后不良。本文雖然未做生存分析得出相應地結論,但小細胞肺癌在肺癌病理分型中預后較差,可間接表明了與Mounawar等[18]的結果一致。在基因突變與臨床病理特征之間的logistic回歸分析中,我們分別進行了EGFR 突變與性別和吸煙史、KRAS 突變與是否轉移、TP53 突變與病理類型之間的二(多)元logistic回歸分析。結果顯示：女性患者EGFR 突變的風險較男性高,不吸煙者發生EGFR基因突變的風險比吸煙者高,明確了性別與吸煙史是肺癌患者發生EGFR 突變的危險因素,表明不吸煙女性患者行基因檢測時須重視EGFR 基因,可為TKI靶向治療提供依據；KRAS基因突變在轉移者與非轉移者間差異具有統計學意義,尚不能認為KRAS突變是肺癌患者發生轉移的危險因素。TP53基因突變在腺癌、鱗癌、小細胞癌3種組織類型腫瘤發生風險的差異均有統計學意義,提示病理類型時肺癌患者發生TP53突變的危險因素,對肺癌病理類型鑒別時作為輔助指標,尤其是對小細胞肺癌。此外,在探討基因相互之間的關系方面,本研究發現EGFR 與PIK3CA 之間有相關性,與KRAS、PTEN、MET、TP53 之間均無相關性,表明EGFR 與KRAS、PTEN、MET、TP53基因不會同時突變。既往有實驗表明EGFR、PTEN、TP53基因在乳腺癌中具有相互調控的作用。KRAS與PTEN、MET、PIK3CA、TP53 之間均顯著相關,可能在針對EGFR 靶向藥物耐藥過程中具有一定的協同作用,亦有文獻表明在結直腸癌轉移灶中 KRAS 與 MET 之間不存在相關性。MET 與PIK3CA 之間有相關性,有文獻提出PIK3CA 基因突變更加傾向于和其他基因突變同時存在,與本研究結果一致[19]。

表2 EGFR、KRAS基因突變與臨床病理特征之間的二元logistic回歸分析

表3 TP53基因突變與病理類型之間的多元logistic回歸分析

綜上所述,基于NGS 技術行血液ctDNA 的EGFR、KRAS、PTEN、MET、PIK3CA、TP53基因檢測是一種良好的檢測方式,實際臨床診斷中適用于無法獲取組織樣本、需重復檢測及靶向治療后持續性檢測等情況。因此NGS技術可反映出肺癌多個基因全貌,具有精準診斷、個體化治療價值。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突