天然磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑的篩選

楊立軍，楊中鐸

(蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 甘肅 蘭州 730050)

磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3Ks)屬于一個(gè)家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)酶，這些脂質(zhì)激酶的主要作用是特異性地催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)的3-位羥基磷酸化，生成有第二信使作用物質(zhì)的磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸酯(PIP3)參與多種生物過(guò)程的調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、生存、增殖、遷移、存活和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸[1-3]。PI3Ks根據(jù)其基因序列，同源性和體外脂質(zhì)底物特異性，被分為3個(gè)不同的類(lèi)別(I類(lèi)，II類(lèi)和III類(lèi))。其中，研究最廣泛的為I類(lèi)PI3K,此類(lèi)PI3K為異源二聚體，由1個(gè)調(diào)節(jié)亞基和1個(gè)催化亞基組成，I類(lèi)PI3K進(jìn)一步分為IA類(lèi)(包括PI3K-α，β和δ)和IB類(lèi)2組，其僅包含1個(gè)成員PI3K-γ[4]。PI3K和其下游分子Akt所組成的信號(hào)通路可以激活下游信號(hào)分子，該信號(hào)分子在眾多的腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起至關(guān)重要的作用[5]，因此，PI3K抑制劑日益成為腫瘤研究者關(guān)注的一個(gè)研究熱點(diǎn)，被認(rèn)為是設(shè)計(jì)腫瘤特異性藥物的潛在靶點(diǎn)[6]。

目前，WELKER等[7-8]利用天然產(chǎn)物分離、化學(xué)合成等手段研究發(fā)現(xiàn)，Wortmannin類(lèi)化合物、黃酮類(lèi)化合物、二萜類(lèi)化合物、嘧啶類(lèi)化合物、喹唑啉類(lèi)化合物、吡啶類(lèi)化合物、喹啉類(lèi)化合物、吲哚類(lèi)化合物、喹喔啉類(lèi)化合物、吡嗪類(lèi)化合物、氮雜茂類(lèi)化合物和三嗪類(lèi)化合物等不同類(lèi)型的PI3K抑制劑。這些抑制劑除Wortmannin類(lèi)化合物外，大多為合成藥物，目前報(bào)道的天然PI3K抑制劑還十分少見(jiàn)。為了獲得天然的PI3K抑制劑，對(duì)40種植物的總生物堿提取物和12種天然viridin類(lèi)似物(與Wortmannin結(jié)構(gòu)相似)的PI3K抑制活性進(jìn)行篩選，以期為腫瘤特異性藥物研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中藥材 40種中藥材樣品，均購(gòu)自蘭州黃河藥材市場(chǎng)安寧醫(yī)藥公司復(fù)興厚藥莊，標(biāo)本保存于蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，由蘭州理工大學(xué)鑒定。12種viridin類(lèi)似物，均為研究小組從踝節(jié)菌屬真菌(TalaromyceswortmanniiLGT-4，GenBank Accession No.KF850714)中分離得到，該菌為雷公藤(Tripterygiumwilfordii)中分離的1株內(nèi)生菌[9]。其中，化合物1～4由丁海娥[9]分離得到，化合物5由孫景云[10]分離得到，化合物6由智康康[11]分離得到，化合物7～12由傅廣超[12-13]分離得到。

1.1.2 儀器 HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)，RE-52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，PHSJ-3D 型pH計(jì)(上海雷磁)，多功能酶標(biāo)儀Spark 10M(瑞士帝肯Tecan)，384孔酶標(biāo)板(美國(guó)Corning Costar公司)，移液槍(Eppendorf)。

1.1.3 藥品與試劑 磷酯酰肌醇-3-激酶(PIK3CA/PIK3R1，20 μg)，底物(PIP2:PS Lipid Kinase Substrate, 400 nmol，Thermo Fisher Scientific)，ADP-GloTMKinase Assay試劑盒(Promega)，GDC-0941( 阿拉丁)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總生物堿的制備 取中藥材粉碎，每100 g樣品粉末用700 mL的95%乙醇水浴回流提取2次，每次2 h。抽濾，合并濾液，濾液在減壓條件下回收乙醇得浸膏。浸膏被懸浮在100 mL蒸餾水中，懸浮溶液用2 mol/L HCl調(diào)pH至2.0～3.0。靜置過(guò)夜后，抽濾，濾液用濃氨水調(diào)pH至10.0～11.0，立刻用等體積的氯仿萃取3次，合并有機(jī)相，減壓條件下回收氯仿得到總生物堿提取物。此生物堿提取物用于PI3K抑制活性的評(píng)價(jià)。

1.2.2 PI3K抑制活性的測(cè)定 采用體外激酶測(cè)定方法測(cè)定化合物的PI3K抑制活性，PI3K酶的活性通過(guò)測(cè)量激酶反應(yīng)后產(chǎn)生的ADP的量來(lái)確定[14]。試驗(yàn)均在室溫下的384孔板中進(jìn)行。

具體實(shí)施步驟：配置激酶緩沖液，其中包括50 mmol/L Hepes (pH7.5)，3 mmol/L MgCl2, 100 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EGTA, 0.03% CHAPS 和2 mmol/L DTT。PI3K激酶使用激酶緩沖液稀釋到0.9 ng/μL。配置ATP/底物混合物，其中包括5 μmol/L PIP2/PS和25 μmol/L ATP。待測(cè)化合物用100%的DMSO稀釋到10 mmol/L。向384孔板中的每個(gè)孔中加入2 μL稀釋的化合物和4 μL的ATP/底物混合物。之后在各個(gè)孔中加入4 μL的PI3K激酶混合液后避光下反應(yīng)1 h。之后在每個(gè)孔中加入10 μL ADP-GloTM試劑，孵育40 min后在每個(gè)孔中加入20 μL激酶檢測(cè)試劑(Kinase Detection Reagent)，遮光反應(yīng)30 min。最后在多功能酶標(biāo)儀中測(cè)量化學(xué)發(fā)光值，計(jì)算抑制率。

抑制率=[1-(化合物組-陽(yáng)性對(duì)照組)/(空白組-陽(yáng)性對(duì)照組)]×100%

其中，空白組用2 μL激酶緩沖液代替2 μL待測(cè)樣品液，陽(yáng)性對(duì)照組用2 μL GDC-0941(10 mmol/L)代替2 μL待測(cè)樣品液，GDC-0941為陽(yáng)性對(duì)照藥品，其IC50為(4.5±0.2) nmol/L。

樣品對(duì)PI3K的半數(shù)抑制濃度(IC50)是通過(guò)測(cè)定樣品不同濃度(50.0 μg/mL、25.0 μg/mL、12.5 μg/mL、3.1 μg/mL、1.5 μg/mL、0.7 μg/mL、0.3 μg/mL和0.1 μg/mL)下的抑制率，最后通過(guò)直線回歸法計(jì)算出待測(cè)樣品的IC50。每個(gè)樣品均做3次平行，取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 40種中藥材總生物堿提取物對(duì)PI3K的抑制活性

從表1看出，槲寄生、馬齒莧、粉防己、大青葉和川芎的的總生物堿對(duì)PI3K具有明顯的抑制活性，其總生物堿在質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)對(duì)PI3K的抑制率分別為81.0%、80.8%、80.7%、86.6%和77.5%，IC50分別為8.8 μg/mL、20.6 μg/mL、8.6 μg/mL、9.9 μg/mL和0.1 μg/mL。麻黃根、萊菔子、款冬花、知母和平貝母的抑制率為50.5%～61.7%，對(duì)PI3K具有中等抑制活性。其余植物總生物堿對(duì)其抑制活性很弱或無(wú)。

表1 40種中藥材總生物堿提取物對(duì)PI3K的抑制活性

續(xù)表1

編號(hào)No.藥材名稱(chēng)Name拉丁名Latin name抑制率/%Inhibition ratioIC50/(μg/mL)16半夏Pinellia ternata49.3Nd17萊菔子Raphanus sativus51.1Nd18馬齒莧Portulaca oleracea80.820.619粉防己Stephania tetrandra80.78.620苦參Sophora flavescens29.6Nd21百部Stemona sessilifolia42.2Nd22白頭翁Pulsatilla ambigua18.0Nd23款冬花Tussilago farfara60.3Nd24知母Anemarrhena asphodeloides61.7Nd25平貝母Fritillaria ussuriensis59.1Nd26白蒺藜Tribulus terrestris31.8Nd27芥子Brassica alba13.7Nd28胡椒Piper nigrum29.5Nd29大青葉Isatis indigotica86.69.930元胡Corydalis humosa8.8Nd31郁金Curcuma aromatica6.9Nd32密蒙花Buddleja officinalis23.8Nd33青風(fēng)藤Sabia japonica17.5Nd34麻黃草Ephedra sinica7.4Nd35金銀花Desmodium styracifolium7.8Nd36雞骨草Abrus cantoniensis12.8Nd37桑葉Morus nigra17.8Nd38板藍(lán)根Rhizome of Isatis indigotica2.3Nd39檳榔Areca catechu41.2Nd40川芎Ligusticum chuanxiong77.50.1

2.2 12種天然化合物對(duì)PI3K的抑制活性

從表2看出，化合物12(Wortmannine C)對(duì)PI3K具有明顯抑制活性，其質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí),對(duì)PI3K的抑制率為74.8%，IC50為6.8 μg/mL。其余化合物對(duì)其抑制活性很弱或無(wú)。

表2 12種天然化合物對(duì)PI3K的抑制活性

3 結(jié)論與討論

研究發(fā)現(xiàn)，槲寄生、馬齒莧、粉防己、大青葉和川芎的的總生物堿對(duì)PI3K具有明顯的抑制活性，其總生物堿在質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)，對(duì)PI3K的抑制率分別為81.0%、80.8%、80.7%、86.6%和77.5%，IC50分別為8.8 μg/mL、20.6 μg/mL、8.6 μg/mL、9.9 μg/mL和0.1 μg/mL。化合物12(Wortmannine C)對(duì)PI3K具有明顯的抑制活性，其質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)，對(duì)PI3K的抑制率為74.8%，IC50為6.8 μg/mL。

川芎嗪通過(guò)酯鍵與丹參素偶聯(lián)形成的DT-010可以通過(guò)激活PI3K/Akt/GSK3b途徑增強(qiáng)肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2D，從而預(yù)防1-甲基-4-苯基吡啶離子誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性[15]，但DT-010是川芎嗪與丹參素偶聯(lián)形成的化合物，所以目前并沒(méi)有研究川芎的生物堿對(duì)PI3K的抑制活性。從馬齒莧中分離得到的(E)-5-羥基-7-甲氧基-3-(2'-羥基芐基)-4-苯并二氫吡喃酮可以通過(guò)激活3T3-L1脂肪細(xì)胞中的PI3K/Akt和AMPK途徑刺激GLUT4易位至質(zhì)膜來(lái)增加葡萄糖攝取[16]。目前并沒(méi)有研究馬齒莧的生物堿對(duì)PI3K的抑制活性。粉防己堿通過(guò)下調(diào)Rac1、Cdc42、RhoA、GTPases和RacA的表達(dá)和激活PI3K/Akt和JNK信號(hào)通路可顯著抑制類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎纖維樣滑膜細(xì)胞的遷移和入侵[17]；漢防己乙素可以通過(guò)抑制SGC7901細(xì)胞中的PI3K/AKT信號(hào)通路而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖和侵襲[18]。目前研究最多的是粉防己堿的藥理活性，而粉防己堿中含有大量生物堿，其PI3K活性成分，有待進(jìn)一步深入研究。目前未見(jiàn)有關(guān)槲寄生和大青葉總生物堿對(duì)PI3K抑制活性的研究。

化合物12(Wortmannine C)是項(xiàng)目組從踝節(jié)菌屬真菌(Talaromyces wortmannii)中分離出來(lái)的一個(gè)具有五元B環(huán)的呋喃甾體類(lèi)化合物，其具有新穎的骨架結(jié)構(gòu)，屬于wortmannin的衍生物，也是viridin類(lèi)化合物家族的一員[12]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，該化合物對(duì)PI3K具有良好的抑制活性，將是一個(gè)新的先導(dǎo)物，值得進(jìn)一步深入研究。