天然磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑的篩選

楊立軍，楊中鐸

(蘭州理工大學 生命科學與工程學院， 甘肅 蘭州 730050)

磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3Ks)屬于一個家族信號轉導酶，這些脂質激酶的主要作用是特異性地催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)的3-位羥基磷酸化，生成有第二信使作用物質的磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸酯(PIP3)參與多種生物過程的調節，包括細胞生長、生存、增殖、遷移、存活和細胞內運輸[1-3]。PI3Ks根據其基因序列，同源性和體外脂質底物特異性，被分為3個不同的類別(I類，II類和III類)。其中，研究最廣泛的為I類PI3K,此類PI3K為異源二聚體，由1個調節亞基和1個催化亞基組成，I類PI3K進一步分為IA類(包括PI3K-α，β和δ)和IB類2組，其僅包含1個成員PI3K-γ[4]。PI3K和其下游分子Akt所組成的信號通路可以激活下游信號分子，該信號分子在眾多的腫瘤發生發展過程中起至關重要的作用[5]，因此，PI3K抑制劑日益成為腫瘤研究者關注的一個研究熱點，被認為是設計腫瘤特異性藥物的潛在靶點[6]。

目前，WELKER等[7-8]利用天然產物分離、化學合成等手段研究發現，Wortmannin類化合物、黃酮類化合物、二萜類化合物、嘧啶類化合物、喹唑啉類化合物、吡啶類化合物、喹啉類化合物、吲哚類化合物、喹喔啉類化合物、吡嗪類化合物、氮雜茂類化合物和三嗪類化合物等不同類型的PI3K抑制劑。這些抑制劑除Wortmannin類化合物外，大多為合成藥物，目前報道的天然PI3K抑制劑還十分少見。為了獲得天然的PI3K抑制劑，對40種植物的總生物堿提取物和12種天然viridin類似物(與Wortmannin結構相似)的PI3K抑制活性進行篩選，以期為腫瘤特異性藥物研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中藥材 40種中藥材樣品，均購自蘭州黃河藥材市場安寧醫藥公司復興厚藥莊，標本保存于蘭州理工大學生命科學與工程學院，由蘭州理工大學鑒定。12種viridin類似物，均為研究小組從踝節菌屬真菌(TalaromyceswortmanniiLGT-4，GenBank Accession No.KF850714)中分離得到，該菌為雷公藤(Tripterygiumwilfordii)中分離的1株內生菌[9]。其中，化合物1～4由丁海娥[9]分離得到，化合物5由孫景云[10]分離得到，化合物6由智康康[11]分離得到，化合物7～12由傅廣超[12-13]分離得到。

1.1.2 儀器 HH-4數顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)，RE-52CS型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)，PHSJ-3D 型pH計(上海雷磁)，多功能酶標儀Spark 10M(瑞士帝肯Tecan)，384孔酶標板(美國Corning Costar公司)，移液槍(Eppendorf)。

1.1.3 藥品與試劑 磷酯酰肌醇-3-激酶(PIK3CA/PIK3R1，20 μg)，底物(PIP2:PS Lipid Kinase Substrate, 400 nmol，Thermo Fisher Scientific)，ADP-GloTMKinase Assay試劑盒(Promega)，GDC-0941( 阿拉丁)。

1.2 試驗方法

1.2.1 總生物堿的制備 取中藥材粉碎，每100 g樣品粉末用700 mL的95%乙醇水浴回流提取2次，每次2 h。抽濾，合并濾液，濾液在減壓條件下回收乙醇得浸膏。浸膏被懸浮在100 mL蒸餾水中，懸浮溶液用2 mol/L HCl調pH至2.0～3.0。靜置過夜后，抽濾，濾液用濃氨水調pH至10.0～11.0，立刻用等體積的氯仿萃取3次，合并有機相，減壓條件下回收氯仿得到總生物堿提取物。此生物堿提取物用于PI3K抑制活性的評價。

1.2.2 PI3K抑制活性的測定 采用體外激酶測定方法測定化合物的PI3K抑制活性，PI3K酶的活性通過測量激酶反應后產生的ADP的量來確定[14]。試驗均在室溫下的384孔板中進行。

具體實施步驟：配置激酶緩沖液，其中包括50 mmol/L Hepes (pH7.5)，3 mmol/L MgCl2, 100 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EGTA, 0.03% CHAPS 和2 mmol/L DTT。PI3K激酶使用激酶緩沖液稀釋到0.9 ng/μL。配置ATP/底物混合物，其中包括5 μmol/L PIP2/PS和25 μmol/L ATP。待測化合物用100%的DMSO稀釋到10 mmol/L。向384孔板中的每個孔中加入2 μL稀釋的化合物和4 μL的ATP/底物混合物。之后在各個孔中加入4 μL的PI3K激酶混合液后避光下反應1 h。之后在每個孔中加入10 μL ADP-GloTM試劑，孵育40 min后在每個孔中加入20 μL激酶檢測試劑(Kinase Detection Reagent)，遮光反應30 min。最后在多功能酶標儀中測量化學發光值，計算抑制率。

抑制率=[1-(化合物組-陽性對照組)/(空白組-陽性對照組)]×100%

其中，空白組用2 μL激酶緩沖液代替2 μL待測樣品液，陽性對照組用2 μL GDC-0941(10 mmol/L)代替2 μL待測樣品液，GDC-0941為陽性對照藥品，其IC50為(4.5±0.2) nmol/L。

樣品對PI3K的半數抑制濃度(IC50)是通過測定樣品不同濃度(50.0 μg/mL、25.0 μg/mL、12.5 μg/mL、3.1 μg/mL、1.5 μg/mL、0.7 μg/mL、0.3 μg/mL和0.1 μg/mL)下的抑制率，最后通過直線回歸法計算出待測樣品的IC50。每個樣品均做3次平行，取其平均值。

2 結果與分析

2.1 40種中藥材總生物堿提取物對PI3K的抑制活性

從表1看出，槲寄生、馬齒莧、粉防己、大青葉和川芎的的總生物堿對PI3K具有明顯的抑制活性，其總生物堿在質量濃度為50 μg/mL時對PI3K的抑制率分別為81.0%、80.8%、80.7%、86.6%和77.5%，IC50分別為8.8 μg/mL、20.6 μg/mL、8.6 μg/mL、9.9 μg/mL和0.1 μg/mL。麻黃根、萊菔子、款冬花、知母和平貝母的抑制率為50.5%～61.7%，對PI3K具有中等抑制活性。其余植物總生物堿對其抑制活性很弱或無。

表1 40種中藥材總生物堿提取物對PI3K的抑制活性

續表1

編號No.藥材名稱Name拉丁名Latin name抑制率/%Inhibition ratioIC50/(μg/mL)16半夏Pinellia ternata49.3Nd17萊菔子Raphanus sativus51.1Nd18馬齒莧Portulaca oleracea80.820.619粉防己Stephania tetrandra80.78.620苦參Sophora flavescens29.6Nd21百部Stemona sessilifolia42.2Nd22白頭翁Pulsatilla ambigua18.0Nd23款冬花Tussilago farfara60.3Nd24知母Anemarrhena asphodeloides61.7Nd25平貝母Fritillaria ussuriensis59.1Nd26白蒺藜Tribulus terrestris31.8Nd27芥子Brassica alba13.7Nd28胡椒Piper nigrum29.5Nd29大青葉Isatis indigotica86.69.930元胡Corydalis humosa8.8Nd31郁金Curcuma aromatica6.9Nd32密蒙花Buddleja officinalis23.8Nd33青風藤Sabia japonica17.5Nd34麻黃草Ephedra sinica7.4Nd35金銀花Desmodium styracifolium7.8Nd36雞骨草Abrus cantoniensis12.8Nd37桑葉Morus nigra17.8Nd38板藍根Rhizome of Isatis indigotica2.3Nd39檳榔Areca catechu41.2Nd40川芎Ligusticum chuanxiong77.50.1

2.2 12種天然化合物對PI3K的抑制活性

從表2看出，化合物12(Wortmannine C)對PI3K具有明顯抑制活性，其質量濃度為20 μg/mL時,對PI3K的抑制率為74.8%，IC50為6.8 μg/mL。其余化合物對其抑制活性很弱或無。

表2 12種天然化合物對PI3K的抑制活性

3 結論與討論

研究發現，槲寄生、馬齒莧、粉防己、大青葉和川芎的的總生物堿對PI3K具有明顯的抑制活性，其總生物堿在質量濃度為50 μg/mL時，對PI3K的抑制率分別為81.0%、80.8%、80.7%、86.6%和77.5%，IC50分別為8.8 μg/mL、20.6 μg/mL、8.6 μg/mL、9.9 μg/mL和0.1 μg/mL。化合物12(Wortmannine C)對PI3K具有明顯的抑制活性，其質量濃度為20 μg/mL時，對PI3K的抑制率為74.8%，IC50為6.8 μg/mL。

川芎嗪通過酯鍵與丹參素偶聯形成的DT-010可以通過激活PI3K/Akt/GSK3b途徑增強肌細胞增強因子2D，從而預防1-甲基-4-苯基吡啶離子誘導的神經毒性[15]，但DT-010是川芎嗪與丹參素偶聯形成的化合物，所以目前并沒有研究川芎的生物堿對PI3K的抑制活性。從馬齒莧中分離得到的(E)-5-羥基-7-甲氧基-3-(2'-羥基芐基)-4-苯并二氫吡喃酮可以通過激活3T3-L1脂肪細胞中的PI3K/Akt和AMPK途徑刺激GLUT4易位至質膜來增加葡萄糖攝取[16]。目前并沒有研究馬齒莧的生物堿對PI3K的抑制活性。粉防己堿通過下調Rac1、Cdc42、RhoA、GTPases和RacA的表達和激活PI3K/Akt和JNK信號通路可顯著抑制類風濕性關節炎纖維樣滑膜細胞的遷移和入侵[17]；漢防己乙素可以通過抑制SGC7901細胞中的PI3K/AKT信號通路而抑制腫瘤細胞的生長繁殖和侵襲[18]。目前研究最多的是粉防己堿的藥理活性，而粉防己堿中含有大量生物堿，其PI3K活性成分，有待進一步深入研究。目前未見有關槲寄生和大青葉總生物堿對PI3K抑制活性的研究。

化合物12(Wortmannine C)是項目組從踝節菌屬真菌(Talaromyces wortmannii)中分離出來的一個具有五元B環的呋喃甾體類化合物，其具有新穎的骨架結構，屬于wortmannin的衍生物，也是viridin類化合物家族的一員[12]。經研究發現，該化合物對PI3K具有良好的抑制活性，將是一個新的先導物，值得進一步深入研究。