微齒菝葜CDDP - PCR體系優化、引物篩選及多態性分析

張晴　臧德奎

摘要：利用正交試驗對微齒菝葜CDDP - PCR反應體系的模板DNA和引物濃度進行優化。最優CDDP -PCR反應體系為：2×Es Taq MasterMix酶（含染料）10μL，0.4μmol/L引物，40 ng DNA模板，ddH7 0補齊至20μL。利用該優化體系從21條通用引物中共篩選出12條條帶清晰、多態性好的引物。利用篩選好的引物對105個微齒菝葜樣品進行擴增，共得到229個位點，其中多態性位點225個，占總位點數的98.25%。本試驗表明CDDP分子標記對于微齒菝葜的遺傳多樣性分析、分子圖譜構建及性狀基因連鎖研究具有重要價。

關鍵詞：微齒菝葜;CDDP分子標記;體系優化;引物篩選;多態性分析

Reaction System Optimization and Primer Screening ofCDDP - PCR and Polymorphism Analysis of Smilax microdontaZhang Qing， Zang DeKui

Abstract

In order to construct the optimal CDDP - PCR reaction system of Smilax microdonta， the or-thogonal experiment was designed with the factors of template DNA and primer concentration. The optimal sys-tem was established as follows ： 2 x Es Taq MasterMix enzyme （containing dyes） 10 μL， 0.4μmol/L prim-er， 40 ng DNA template， and ddH20 supplemented t0 20 μL. A total of 12 primers with clear bands and goodpolymorphism were screened from 21 universal primers using the optimized system. One hundred and five sam-ples of Smilax microdonta were amplified with the screened primers， and 229 loci were obtained， of which 225were polymorphic loci， accounting for 98.25% of the total number of loci. This experiment demonstrated thatCDDP molecular markers were of great value for genetic diversity analysis， molecular map construction and studyon linkage of trait genes of Smilax microdonta.

Keywords Smilax microdonta; CDDP molecular marker; System optimization; Primer screening; Poly-morphism analysis

微齒菝葜（Smilax microdonta）為菝葜科菝葜屬落葉小灌木，零星分布于山東省棗莊市抱犢崮、湖北省神農架和江蘇省宜興市，與菝葜近緣[1]。菝葜屬植物在民間以根莖人藥，植株中含有甾體皂苷類、黃酮類、甾醇類、芪類和苯丙素等類型化合物，對心血管疾病的防治、免疫調節、抗菌抗炎、抗病毒、抗癌等具有良好的作用，臨床療效確切[2-4]。微齒菝葜形態與菝葜相似，在分類上易混淆[5]，往往造成藥材的誤采、誤收、誤用等問題。近年來，因過度采挖，分布區旅游開發加上河流沖刷等自然條件干擾，微齒菝葜生境破壞嚴重，野生資源有所減少。因此對種質資源進行保護和遺傳多樣性研究十分必要。CDDP（ conservedDNA - derived polymorphism）分子標記是Collard和Mackill在2009年開發的一種基于DNA保守序列的新型分子標記技術[6]。它針對植物功能基因或基因家族中保守氨基酸序列設計單條引物，可產生偏向候選功能基因區的顯性多態性標記，其PCR擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳即可分離，多態性豐富，穩定性好。與隨機分子標記相比，CDDP分子標記可更有效地與目標性狀連鎖，具有操作便捷、應用成本低、引物設計簡單且通用性良好等優點，在遺傳多樣性分析和分子標記輔助育種中具有重要的應用價值，前景較為廣闊[7]。目前CDDP分子標記已成功應用于大豆[8]、牡丹[9]、菊花[10]、越橘[ll]、野生玫瑰[12]和鐵皮石斛[13]等資源的遺傳多樣性分析、品種鑒定以及性狀關聯研究等方面。

由于微齒菝葜發現時間較晚，目前尚無相關的研究報道。本研究以山東省棗莊市分布的微齒菝葜為材料，利用正交試驗建立并優化其CDDP -PCR反應體系，進而對該體系進行穩定性驗證、篩選高效的CDDP引物、應用該分子標記分析微齒菝葜資源的多態性，以期為后續微齒菝葜遺傳多樣性分析和分子標記育種奠定基礎，同時為藥用資源的合理開發與應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

微齒菝葜分別采自山東省棗莊市抱犢崮景區、東莊和徐莊。采集無病蟲害和機械損傷的新鮮嫩葉，共105份樣品，經硅膠干燥，于-20℃冰箱保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 總DNA提取 DNA提取參考改良CTAB法[14]并做相應改進。具體操作如下：取0.15～0.18g干燥葉片，加少許聚乙烯吡咯烷酮和抗壞血酸，液氮研磨成粉末后轉移至2mL離心管中，加入1mL預冷提取介質，混勻，4℃靜置10 min后離心，棄上清，重復2～3次，至上清液清透;加入50μL β-巰基乙醇、800μL預熱的CTAB緩沖液和10μL蛋白酶K溶液，顛倒混勻，65℃水浴th，并不時輕微振蕩;冷卻至室溫，加200 μLTris酚試劑、600 μL氯仿異戊醇（24：1），顛倒混勻10 min，40℃、12000 r/min離心10 min;轉移上清液至新離心管，加入等體積的氯仿異戊醇（24：1），輕輕顛倒混勻10 min，40C、12 000 r/min離心10 min，重復兩次該步驟;加50 μL 3 mol/L醋酸鈉，顛倒混勻，10 000 r/min離心5 min;加800 μL預冷無水乙醇，-20℃靜置30 min;4℃、12000 r/min離心3min;70%乙醇洗滌DNA沉淀3次，室溫干燥30min，加50μL TE溶解DNA。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，Nano-drop 2000分光光度計測定純度和濃度，-20℃保存備用。